基孔肯雅病毒检测方法及进展

吴忠华，秦秀英，罗鹏

浙江国际旅行卫生保健中心，浙江 杭州 310003

基孔肯雅热（Chikungunya fever，CHIK）是由基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）引起，以伊蚊等为主要传播媒介，以发热、皮疹及关节疼痛为主要临床特征的急性传染病[1]。

CHIKV 属披膜病毒科甲病毒属，1997 年被正式命名，为单股正链RNA 病毒，其基因组RNA 总长11 805 个核苷酸。该病毒呈嗜热性，在温带地区不宜生存，且具有3～4 年的间歇性流行特点，大多是在雨季过后开始暴发流行。1952年，CHIK首次在坦桑尼亚南部尼瓦拉州流行；20 世纪60 年代以后，CHIK流行区域不断扩大，向东推移至东南亚地区，并一步步逼近我国南方[2-3]。2008 年3 月，广东检验检疫局卫生检疫实验室从赴斯里兰卡务工回国的劳务人员血清样本中检测出CHIKV，是我国首例CHIK 输入性病例。CHIK 临床表现和登革热等极其相似，容易造成误诊。目前CHIK 主要的检测技术有病毒分离培养、血清学检测和分子生物学检测等。我们对CHIKV的实验室检测方法及研究进展进行综述。

1 病毒的分离培养

CHIKV 可在C6/36、BHK-21、Vero、HeLa 及原代地鼠肾细胞和非洲绿猴肾Vero76 细胞中增殖，也可用乳鼠、蚊虫等进行增殖[4-5]。Lakshmi 等将32例经RT-PCR 检测为CHIKV 阳性的患者血清用C6/36 细胞进行培养，20例培养阳性[6]。Dash 等[7]对22例CHIKV 确诊病 例血清进行培养，20例阳性；45例CHIKV 阳性血清用BHK-21 细胞培养，阳性15例，同时用RT-LAMP 法检测，阳性38例。病毒分离方法包括乳鼠脑内接种、脊椎动物细胞培养、蚊虫细胞培养等，最常用的分离方法是细胞培养法。病毒分离培养是CHIKV 实验室诊断的金标准，特异性高，不仅可用于疾病的诊断，同时还可对所分离毒株进行来源、特征等方面的鉴定。但该方法对实验技术、条件等要求高，所需时间长，灵敏度相对较低，限制了其临床应用推广。

2 血清学检测

2.1 间接免疫荧光法

间接免疫荧光法是将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应的抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少；缺点是敏感性偏低，每检查一种抗原就须制备一种荧光抗体，需要荧光显微镜，观察结果须特殊培训。Litzba 等[8]报道，CHIKV IgM和IgG 在病人临床发作3～6 d 后即可检测到，用德国欧蒙公司生产的间接免疫荧光检测试剂盒评价了在印度洋地区感染的归国旅行者，结果显示CHIKV IgM 抗体的特异性为93.3%、敏感性为96.9%，CHIKV IgG 抗体的特异性为100%、敏感性为95.4%。该方法是诊断CHIKV感染的较好方法。

2.2 ELISA法

ELISA 常用于病毒特异性抗原和抗体检测，具有良好的特异性和灵敏度。任瑞文[9]等建立了检测CHIKV的ELISA方法，经生物信息学分析，选择其中25 段抗原性预测得分值较高的片段，构建原核表达载体，经诱导，其中11 个片段获正确表达，用Western 印迹筛选，结果显示CHIKV19 融合表达片段表现出良好的抗原反应性及特异性，筛选的重组抗原具有良好的特异性，与所试参考多抗无交叉反应；对鼠抗CHIKV多抗检出范围为1∶100～1∶12 800；对54份CHIKV 患者血清标本进行检测，结果均为阳性，与实时荧光PCR 结果相符，与登革热患者和健康体检人群无交叉反应。

2.3 胶体金免疫层析法

免疫层析法是将已知抗原或抗体先包被于硝酸纤维素膜的某一区带，加入样本后，在毛细管作用下，样品沿着该膜向前移动，样品中相应的抗体或抗体即与包被抗原或抗体发生特异性结合，再通过胶体金实现特异性的免疫诊断。目前已有相应的CHIKV 胶体金免疫层析法商品化试剂盒，该方法操作简单、快速，适用于快速筛查。如Onsite Chik IgM Rapid Test 试剂盒，即利用免疫层析法从患者血清中快速检测病毒抗体IgM[10]。Chob 等报道，用C6/36 细胞培养CHIKV 后提取RNA，用PCR 扩增衣壳蛋白基因，然后亚克隆到杆状病毒载体pFastBac HT 上，构建重组病毒，以Sf900ⅡSFM 细胞表达产生衣壳蛋白，纯化后用作抗原，以胶体金标记抗人IgM，建立胶体金免疫层析法，该胶体金免疫试纸条检测抗CHIKV-IgM 的灵敏度为87.5%（35/40），与健康人血清、抗登革病毒阳性血清不发生交叉反应，特异性为100%[11]。

2.4 免疫印迹法

免疫印迹法（immunobiotting test，IBT）是凝胶电泳与抗原抗体反应相结合的一项检测技术，具有分析容量大、分辨率高、特异性强等特点。IBT 包括三个步骤，首先为凝胶电泳，接着进行电转移，最后为免疫显色。Kowalzik等[12]用该方法对30例CHIKV阳性患者进行检测，22例阳性。目前该方法的临床应用较少。

2.5 血凝抑制试验

某些病毒或其血凝素能使某种动物红细胞发生凝集，当加入足够的特异性抗体后，抗原抗体的结合就阻止了红细胞与该病毒或血凝素的接触，从而抑制了红细胞的凝集。在适宜条件下，CHIKV 能使鸽子红细胞发生凝集[13]。Padbidri等[14]报道血凝抑制试验具有操作简单快速、敏感性强、无需特殊仪器等优点，但因与其他病毒（如登革病毒、西尼罗病毒等）存在交叉反应，有假阳性，致使较难分析结果。

2.6 中和试验

中和试验是用抗体使相应抗原（毒素或病毒）的毒性或传染性消失的试验。该方法特异性高，敏感性强，可作为CHIK 的确诊试验，但需CHIKV 活病毒，实验操作具有一定的危险性，且目前我国规定CHIKV 的培养须在BSL-3 实验室内进行，因此限制了该方法的推广及应用[15]。

3 分子生物学检测

与传统的病毒分离法相比，分子生物学检测方法的敏感性更高，更快速。随着分子生物学技术的飞速发展，RT-PCR 技术、实时荧光定量PCR 技术和LAMP 技术等都可用于病毒的检测，目前应用较多的有以下几种。

3.1 RT-PCR

RT-PCR是以RNA为模板逆转录生成cDNA，再以此为模板进行扩增。蔡绪禹等[16]筛选了JEV、TBEV、EEEV、WEEV、CHIKV 等5 种病毒的基因保守区域作为引物，建立了多重RT-PCR，具有良好的特异性和敏感性，且可同时检测5 种病毒，相对简单快速。该试验还可通过增加扩增效率低的片段引物浓度，减少扩增效率高的片段引物浓度等方法，有效解决了多重PCR扩增片段大小不一导致的扩增效率不平衡问题。

3.2 实时荧光PCR

实时荧光PCR具有快速、直观、灵敏度和准确度高、特异性好等特点，感染初期即可检测出，适用于早期诊断。实时荧光PCR 与普通PCR 相比，具有所需时间更短、灵敏度更高、定量、直观等优点。余蓓蓓等[17]建立的同时检测西尼罗病毒和基孔肯雅病毒的双重荧光定量PCR，灵敏度达10 拷贝/μL,标准曲线相关系数分别达0.999、0.998，具有较高的准确性和稳定性。燕清丽等[18]建立了CHIKV的纳米金实时荧光PCR 方法，较普通的实时荧光PCR 具有更高的扩增效率，且在相同条件下，该方法的所有病毒滴度稀释梯度的灵敏度都比普通方法提高1～3 倍，因而对低病毒载量的病原体具有更好的检出率。Chen等[19]建立了用2，7-二氨基-1，8-二氮萘衍生物（DNAP）的发夹引物扩增CHIKV 的NSP2 基因，该方法具有较高的敏感性，很强的特异性，与登革病毒和西尼罗病毒等无交叉反应，用临床诊断为CHIKV 感染的病人标本进行验证，所有感染者检测结果皆为阳性，特异性和敏感性都为100%。此法可用于CHIKV感染急性期的诊断。

3.3 半巢式RT-PCR

半巢式RT-PCR 是在普通PCR 的前提下，用3条引物先后扩增靶片段的一种技术，内外套引物共用一条上游或下游引物，在保持较好特异性和敏感性的前提下，降低了引物设计的难度和成本，继续扩增比普通PCR小的片段。Rianthavorn等用该方法对179例经ELISA 法检测IgM 抗体确诊为CHIK 患者的血清进行检测，其中139例检测为阳性，阳性率为77.7%。病毒血症初期（发热开始2～4 d）的血液样本用半巢式RT-PCR 法检测，结果阳性率为100%，适合CHIKV感染的早期诊断[20]。

3.4 LAMP技术

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是新开发的一种恒温核酸扩增技术，该方法针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，在63℃左右恒温条件下，利用链置换DNA 聚合酶即可完成基因扩增。由于不须改变温度，扩增时间短，操作简单，不需大型仪器，适合基层医疗单位。李小波等[21]建立的基孔肯雅病毒LAMP 检测方法，对CHIKV 的最低检出限达到27 拷贝/反应，其灵敏度介于普通PCR和实时荧光PCR 之间，对6 份入境患者及5 份CKIKV 样本的检测结果均为阳性，而对乙脑病毒、登革病毒等的检测结果均为阴性，说明该方法具有良好的特异性及灵敏度。

3.5 RIDA技术

核酸快速等温放大检测（rapid isothermal detection and amplification，RIDA）技术是由李翔等[22]发明的一种新的核酸等温检测技术，具有以下优点：①在同一个温度条件下完成反应，避免了使用价格昂贵的PCR温度循环仪，没有条件限制，可以普遍使用；②通过设计合成特殊结构的检测探针，以便分离检测，消除背景干扰，具有很好的特异性；③不需要DNA 聚合酶等复杂酶及反应体系，反应体系简单；④快速，5～10 min 完成反应，20～30 min 完成检测并得到结果；⑤可同时检测多种不同目标序列，可用于病毒的分型；⑥可同时检测DNA 及RNA；⑦原理简单，易于推广应用。但据研究显示，该方法的灵敏度相对较低。

3.6 NASBA方法

依赖核酸序列的扩增（nucleic acid sequencebased amplification，NASBA)技术是一项以RNA为模板进行等温核酸扩增的检测方法，该方法由一对引物介导，进行连续均一的核酸扩增。相对于逆转录PCR，NASBA可以在相对恒温的条件下进行，更为稳定、准确。Telles 等以CHIKV E1 基因设计的RTNASBA，对250例阴性标本和252例阳性标本的检测结果与RT-PCR一致[23]。

4 结语

基孔肯雅热目前虽仍主要在非洲、东南亚和印度洋等地区流行，但随着全球化的进展，我国又具备CHIKV 的传播条件，CHIKV 一旦被携带传入，就很有可能在我国引起流行。由于我国目前很少有人感染CHIKV，人群对其的免疫力普遍低，增加了基孔肯雅热流行的风险，疫情一旦暴发，必将给我国带来严峻的公共卫生问题及巨大的经济损失。因此，必须提前做好防控措施，而研发早期有效的检测诊断技术显得极其重要。目前适于早期诊断CHIKV 的检测方法主要为分子生物学法，该方法快速、准确，灵敏度高。

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