细胞因子和microRNA与结核分枝杆菌感染的研究进展

蒋纾芳，张嵘，冯晓燕

1.军事医学科学院 基础医学研究所，北京 100850；2.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016

结核病是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所致的以呼吸系统感染为主的慢性传染病。近年来，结核疫情愈发严重，其感染后患者的病亡率位居我国传染病的首位。大多数人感染MTB 并无临床症状，称为结核潜伏感染[1]。研究表明，5%～10%的潜伏结核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）人群可转化成活动性结核病[2]，这表明遗传因素在调节MTB 感染的过程中扮演着非常重要的角色[3]。潜伏感染不断转变成活动性结核，是造成结核病发病率居高不下的重要原因。因此，LTBI为结核病的控制和诊断带来了巨大挑战。联合国已将结核病列为21世纪重点控制的三大疾病之一。

MTB 是胞内寄生菌，侵入机体内是否发病不仅与感染细菌的毒力和数量等因素相关，还与机体的免疫功能相关。当机体感染MTB 后，胞内寄生的特点使它免于抗体的攻击，因此，普遍认为细胞免疫在抗结核感染的过程中发挥了重要作用。但是由于MTB的逃避机制，使得抗原不能顺利呈递，从而导致获得性细胞免疫不能快速启动，感染逐步形成[1]。而且，在感染MTB 的人群中发现，MTB 也能依靠microRNA（miRNA）激发对抗宿主细胞的免疫反应[4]。作为基因表达的调控因子，每个miRNA 都能调节数百个靶基因[5]，通过基因标记进行靶向调控；同时，由于miRNA 高甲基化与一些抑制免疫系统调控的基因甲基化密切相关，miRNA 也可以通过高甲基化来抑制免疫系统调控[6]。因此，检测机体内细胞因子、miRNA 水平的变化，对了解结核病发展、转归及预防、诊治有重要意义。本文就细胞因子、miRNA和结核感染之间的关系进行简要综述。

1 细胞因子

1.1 细胞因子的概念及生物学特征

细胞因子一般是相对分子质量为8×103～80×103的多肽或糖蛋白，其成熟分泌型分子所含氨基酸残基多在200 个左右，不同细胞因子的氨基酸序列无明显同源性（少数例外）。多数细胞因子以单体形式存在，少数以二聚体（如IL-5、IL-12、M-CSF、TGFβ）或三聚体（如TNF）形式存在。

大多数细胞因子以自分泌、旁分泌的形式发挥局部效应，在一定条件下，某些细胞因子也可以内分泌形式作用于远端靶细胞，介导全身性反应。细胞因子须与靶细胞表面相应受体结合才能发挥其生物学效应，由于细胞因子及其受体间的亲和力很高，故极微量（pmol/L 水平）即可发挥明显的生物学效应。细胞因子的生物学效应很复杂，具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性和双向性特点。细胞因子的产生、生物学作用、受体表达、相互调节等均具有网络性，它们之间可以相互诱生，形成相互正向或负向调节的网络，而且，细胞因子可调节其受体的表达，其受体也可调节细胞因子的活性[7]。

1.2 细胞因子与结核感染

MTB 与宿主相互作用的研究显示，MTB 感染始于MTB 的吸入，其病原体可被肺部的吞噬细胞破坏。吞噬细胞是清除致病微生物的重要效应细胞，它的生物学功能涉及定向迁移、识别、吞噬和杀菌等，它杀死MTB 的能力可通过细胞因子调节，Th1型细胞因子可增强其能力，Th2 型细胞因子可通过抑制Th1型细胞因子降低其能力[8-9]。有研究表明，Th1型和Th2 型细胞因子表达水平的相对高低，是诱导和维持MTB感染的重要因素[10]。

在机体抗MTB 感染的免疫防御中，T 淋巴细胞亚群比例及相关细胞因子被认为是决定细胞免疫强弱的主要因素。其中，Th1细胞主要产生Th1型细胞因子如IFN-γ、IL-2等，在胞内病毒和细菌感染的保护性免疫中起重要作用；Th2细胞主要产生Th2型细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13、IL-25等，对于清除胞外寄生虫起关键作用[11]。在正常机体内，Th1/Th2 细胞处于相对平衡状态，通过细胞因子相互交叉调节彼此的活性，一旦机体的免疫功能失常，这种平衡状态就会被打破，从而引起结核病的发生和发展[12]。Th1/Th2 型细胞因子水平已成为结核病疫苗免疫原性评价的重要指标，有利于刺激Th1细胞反应和Th1型细胞因子分泌的疫苗才具有研究价值。另外，Th1/Th2 型细胞因子水平还能应用于结核感染的诊断，如IFN-γ释放实验（IFN-γ release assay，IGRA）就是近年出现的一种检测MTB 感染的方法，它通过T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）诊断结核感染的发生，即以特异性抗原为刺激源，通过应用酶联免疫斑点技术（ELISPOT）来检测外周血单核细胞（PBMC）中释放的IFN-γ数量，以此判断测试结果[13]。

1.3 与结核感染相关的主要细胞因子

1.3.1 IFN-γ IFN-γ即γ干扰素，是一种异型糖蛋白，主要由抗原和有丝分裂原等刺激活化的CD4+Th1 型、CD8+细胞和NK 细胞产生，通过与相应的受体结合，可发挥抗病毒、影响细胞生长分化、抗肿瘤及免疫调节等生物活性。它在抗MTB 感染免疫反应中起关键作用，通过促进T 细胞的增殖和分化，激活巨噬细胞，参与结核病的肉芽肿免疫反应等多方面发挥抗结核免疫作用。IFN-γ是机体发挥抗结核保护性免疫的重要细胞因子，通过检测结核病人血清中的IFN-γ水平发现，结核组IFN-γ比对照组低，复治病例组比初治组低，这表明体内IFN-γ水平降低则机体保护性免疫力也降低，从而引起结核感染患者发病。

1.3.2 TNF-α TNF-α 即α 肿瘤坏死因子，它和IFN-γ均是Th1细胞分泌的特征性细胞因子，能够增强巨噬细胞的杀菌作用，促进结核肉芽肿形成，同时它也是重要的促炎症反应性细胞因子，与发热、恶液质形成及结核病炎性反应程度相关。具有生物活性的TNF-α的产生与机体的免疫状态以及所感染MTB 株的毒力有关，在防止感染部位扩散的过程中起关键作用。TNF-α水平适中对机体有免疫调节作用，过高则可对机体产生免疫损伤。

1.3.3 IL-4 IL-4 即白细胞介素4，主要由CD4+T淋巴细胞分泌，介导Th2 型免疫反应，目前多数研究认为它在结核免疫中主要起负性作用。有研究表明，在MTB 刺激的淋巴细胞内IL-4 促进CD30 的表达，使淋巴细胞对TNF 介导的细胞凋亡更加敏感。更有多项研究证明，未经治疗的、病灶范围大的、有空洞形成的患者血清中IL-4 水平显著高于病灶范围小的患者，存在Th1 反应（主要包括IFN-γ）减弱、Th2 反应（主要包括IL-4）增强现象[14]，而IL-4 基因突变或敲除小鼠较易导致肉芽肿的形成。

1.3.4 IL-6 IL-6 即白细胞介素6 是B 细胞刺激因子，由T 细胞和巨噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞等产生，具有多重免疫调节功能，参与早期炎症反应，在结核病人的外周血中浓度显著升高[15]。MTB 感染中，IL-6 是分泌IFN-γ的T 细胞被激活所必需的细胞因子，而且它还是一种主要的诱导保护性T 细胞的因子，可加强IFN-γ的作用强度。

1.3.5 IL-10 IL-10 即白细胞介素10，主要由Th2细胞分泌，介导免疫抑制，抑制Th1 细胞应答，能够阻断巨噬细胞内MTB 吞噬体的成熟[16]。有研究表明，IL-10 能使慢性MTB 感染者肺内的MTB 快速大量复制，并降低抗MTB 感染中起保护作用的TNFα、IL-12 p40和抗原特异性IFN-γ的分泌[17]。与之相反，也有研究发现IL-10 能够通过使树突状细胞转化为类巨噬细胞来抑制MTB 的生长，因为后者对MTB有更强的吞噬作用。

1.3.6 IL-18 IL-18即白细胞介素18，是一种IFN-γ诱导因子，可刺激Th1 细胞产生IFN-γ，抑制IL-10的分泌。它也具有活化NK 细胞的作用，使T细胞向Th1 细胞功能极化发展，同时还可增加FasL 介导的细胞毒活性，在细胞免疫介导组织损伤中起重要作用。靶向破坏IL-18 基因会使感染MTB 的鼠体内IFN-γ水平下降，并出现明显的肉芽肿反应，外源性IL-18能抑制此过程，且这种作用不能被其他的细胞因子所代替。有研究表明，结核病患者外周血中IL-18 表达明显上调，且与肺部病变程度、临床症状呈明显相关性。此外，血循环中IL-18水平与IFN-γ水平也呈正相关。

1.3.7 IP-10 IP-10 即IFN-γ诱导蛋白10，是趋化因子CXC 亚家族的一种小分子趋化因子，在炎症部位对淋巴细胞的活化和趋化起重要作用。病毒和细菌感染的细胞能够分泌IP-10，细胞免疫过程中T 细胞分泌的IFN-γ和TNF-α能够诱导IP-10的分泌，在IFN-γ或脂多糖的诱导下多细胞参与分泌IP-10，因此细胞免疫中IP-10 的浓度高于IFN-γ，显著放大IFN-γ的信号功能[18]。有研究发现MTB 特异性肽融合抗原刺激肺结核患者的PBMC 能够诱导产生高浓度的IP-10[19]，联合检测IP-10 能够提高MTB 感染的IGRA 敏感性[20]。Lighter 等[21]发现，与IFN-γ相比，全血IP-10 含量没有年龄依赖性，它对于儿童结核病的诊断价值大于IGRA。Farhat 等[22]发现并证实IP-10水平和LTBI 有较好的相关性；但Whittaker 等[23]的研究表明，在接受结核特异性抗原刺激前后，LTBI患者体内IP-10 水平均高于活动性肺结核患者，但两者之间并无显著差异，故IP-10 并不能区分LTBI和活动性肺结核。

2 miRNA

2.1 miRNA的概念及生物学功能

miRNA 是一类来源于内源性染色体上的非编码单链调节RNA，长度约为22个核苷酸，以单拷贝、多拷贝或基因簇等形式存在于基因组中，且绝大部分定位于基因间隔区。它通过激活或抑制基因转录来调控基因表达，在机体的生理发育、疾病的发生和发展过程中发挥重要作用，可作为不同生理和病理状态的分子标记[24]。miRNA 具有高度的保守性、时序表达特异性和组织表达特异性，值得一提的是特定的miRNA 表达在特定的细胞中，且这种组织特异性表达方式的miRNA约占50%。

2.2 miRNA与结核感染

MTB 感染后临床表现多样，分为LTBI、活动性肺结核和肺外结核病，其中较难诊断的是儿童肺结核和HIV 共患肺结核。为了提高诊断质量，发展基于宿主生理指标的诊断检测技术已迫在眉睫[3,25]。考虑到miRNA 在基因表达中扮演的重要角色，它可能会作为有价值的生物指标来区分活动性肺结核和LTBI。研究表明，与正常人相比，LTBI 患者血清中的miR-130b*、miR-342-5p、miR-155、miR-181b、miR-548b-3p 表达下调[26]。Li 等发现，miR-146a 基因多态性通过调节TLR 信号通路强度进而调节对MTB 感染的易感性[27]；另有研究显示，miR-146a 的表达水平在肺结核患者体内明显低于正常对照组。这些均提示miR-146a 参与了肺结核的发生发展过程。

2.3 与细胞因子相关的miRNA

2.3.1 miR-29 体外和临床研究显示，人感染致病性分枝杆菌后miR-29会过表达[28]，它通过下调IFNγ水平来抑制宿主对MTB 的免疫反应[29]。此外，Ma等[30]筛选到了MTB感染后在Ⅱ型干扰素分泌型免疫细胞中显著下调的miR-29。体外实验证明，miR-29家族成员均可以直接靶向IFN-γ的3'非翻译区，从而抑制其表达。表明miR-29 可以通过靶向IFN-γ的产生而调控抗细菌感染相关的免疫应答，为MTB防治提供了新的策略和潜在靶标。

2.3.2 miR-144* Liu 等[31]利用以寡核苷酸为基础的芯片分析技术，在肺结核患者PBMC 中发现了28种上调的和2 种下调的miRNA，对上调的miR-144*进行功能分析发现其可以抑制IFN-γ和TNF-α的产生，从而抑制T 细胞的增殖。由于IFN-γ和TNF-α在保护性免疫反应中具有重要作用，所以miR-144*的过表达能影响结核病的发展。

2.3.3 miR-155 miR-155 已被确定是一个多功能的miRNA，它参与包括感染、炎症和免疫的多个生物过程。有研究显示，敲除miR-155 小鼠模型会导致IL-4 的表达上调而IFN-γ的表达下调，这表明在调节T 细胞依赖性反应中miR-155 有着非常重要的作用[32]。同时，miR-155 还能通过增强TNF mRNA的稳定性和半衰期来增加TNF的产生[33]。

2.3.4 miR-21 在体内或体外感染牛分枝杆菌卡介苗（BCG）后，非敏化的树突状细胞和巨噬细胞中miR-21 上调[34]，在MTB 的ESAT-6 抗原入侵巨噬细胞后miR-21也上调[35]。有研究表明，miR-21抑制促炎细胞因子的表达和促进抗炎细胞因子如IL-10 的产生[36]。miR-21 的抑制剂能诱导IL-12 的产生并引发更强的抗MTB 反应，同时它还能通过直接靶向IL-12 mRNA 的3'非翻译区来抑制IL-12的表达，从而抑制宿主Th1反应。在MTB感染后它也能下调某些保护性细胞因子，如IL-6、TNF-α的表达，但这些细胞因子的水平在ESAT-6 暴露时变化不显著。因此，miR-21可能是MTB用来逃脱宿主免疫反应和建立慢性感染的有效策略。

3 结语

MTB 感染人群数量庞大，目前对其早期的诊断尚无统一的金标准。近几年来被广泛研究的IGRA技术的诊断敏感性和特异性较其它方法有所提高，但在复杂的情况下诊断结果不理想，且花费高昂，对实验室的要求也较高，难以普及。miRNA 作为新的标记物，在结核病诊断方面发展迅速，越来越多的关键miRNA 已被发现，其中个别miRNA 还能影响T 细胞的发育，如miR-29 可以通过直接靶向IFN-γ参与控制抗胞内菌感染相关的天然免疫和获得性免疫，这为今后设计胞内菌防治方法提供了新策略[37]。相信通过研究感染MTB 患者体内miRNA和细胞因子的相互影响，能为更快速、更准确的MTB 诊断开辟新方向。

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