基因修饰的间充质干细胞临床研究进展

2014-04-08 15:22孙辉综述孙涛审校
生物技术通讯 2014年6期
关键词:基因修饰成骨干细胞

孙辉 综述,孙涛 审校

海军总医院 消化内科,北京 100048

20世纪70年代中期,Friedenstein 等第一次将大鼠骨髓来源的骨髓成祖细胞定义为间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)[1]。MSC 可来源于骨髓、脂肪、血、肺、脐带、脐血、胎盘等组织,多项研究均表明在适宜环境下MSC 可分化成内胚层、中胚层,甚至外胚层细胞,具有向成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌、软骨细胞、平滑肌、肌腱细胞等中胚层细胞分化的能力,同时可以向外胚层的星形胶质细胞、神经元、血管内皮细胞、心肌细胞、胰岛素分泌细胞等分化。其跨系、甚至跨胚层横向分化的可塑性及强大的分化潜能使它适用于组织修复。MSC还可逃避免疫识别,抑制免疫反应,所以被称为免疫原性细胞。因此,MSC 在细胞再生和免疫调节方面具有广泛的应用前景。

1 基因修饰技术及修饰后MSC的优越性

基因修饰主要是指利用生物化学方法修改DNA 序列,将目的基因片段导入宿主细胞,或者将特定基因片段从基因组中删除,从而达到改变宿主细胞基因型或使得原有基因型得到加强的作用。修饰基因一旦导入细胞,即可超表达特定基因或构建的基因,不断合成特定蛋白质,使其对高血糖、激素浓度或药物、化学因素等生理刺激反应更敏感。

相比其他成体干细胞(造血干细胞、神经干细胞等)而言,MSC 具有明显的营养和免疫调节特性,更适用于治疗退行性疾病。据报道,静脉注射MSC 已成功治疗移植物抗宿主病、成骨不全等多种系统性疾病,Wakitani 等发现已有多例使用MSC 治疗软骨不全的成功临床案例[2]。原始或基因修饰的MSC 也可应用于肝脏、心肌、神经、骨、肌腱及其他结缔组织的再生中。对于除器官移植再无其他治疗方法的疾病,MSC 移植无疑让患者看到了曙光。但原始MSC植入宿主后有存活时间短、损伤部位聚集浓度低等缺点,而基因修饰的MSC 能克服以上缺陷。通过优化干细胞和载体选择,在MSC 内有效导入特定基因,并通过体外实验验证修饰后的MSC 表达蛋白的能力,将其应用于临床,可治疗获得性和遗传性疾病。

2 基因修饰的MSC的临床应用

2.1 人工肝

据研究,在分离培养的早期肝细胞中加入曲古柳菌素A(trichostatin A,TSA)后可阻断细胞周期的G0/G1,以维持肝细胞功能[3]。因此,在人MSC(hMSC)内预先注入1μL TSA,并用肝源刺激因子预处理6 d,即可分化成显型且功能特点与原始肝细胞类似的细胞[4],特别是当加入基因调节剂组蛋白去乙酰化酶抑制剂时,就可促进肝源祖细胞分化成全能肝细胞。一般情况下,基因调节剂可影响细胞进程的多个阶段(细胞周期、分化、凋亡等),因此,通过基因修饰可有效培养早期肝细胞。鉴于以上原理和事实,基因修饰对基因表达和细胞命运至关重要,在此过程中,导入时机、计量和环境条件是主要影响因素[5]。

2.2 糖尿病

胰腺移植是目前治愈1 型糖尿病的惟一方法,胰腺供体的匮乏,大大促进了细胞替代疗法的发展。MSC 的组织再生和免疫调节特性,可促进血管生成、胰腺β细胞再生和避免移植排斥反应,结合现已取得的基因疗法的研究成果,基因修饰后的MSC进一步发挥原始MSC 的治疗优势,重获干细胞样特性。通过基因修饰或改变培养环境,来源于胰腺、骨髓、脂肪、脐带等组织的MSC 有分化成胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells,IPC)的潜能,因此MSC为胰岛移植提供了另一种β细胞的来源。Li 等[6]在体外实验中,通过腺病毒载体转导Pdx1(pancreatic duodenum homeobox protein-1)到hMSC 内,可诱导其分化成功能性IPC,还可表达多种胰岛细胞基因(neurogenin 3 因子、胰岛素、半乳糖激酶、胰高血糖素),在葡萄糖调节模式中释放胰岛素或C 肽。在动物实验中,移植Pdx1 基因修饰的hMSC 到链脲菌素诱导的糖尿病小鼠模型,可促进胰岛再生,2 周内小鼠血糖就可达到正常水平,并维持至少42 d,并在受体肾小囊内发现了可表达胰岛素的移植细胞。因此,基因修饰的hMSC可作为治疗糖尿病的新方法。

2.3 心梗

近十年,关于MSC 的研究越来越多,尤其在心梗的治疗中,MSC的可塑性、归巢和炎性调节特性对因动脉堵塞引起的心肌缺血损伤有良好的修复作用。基因修饰的MSC 可促进内皮细胞分化和血管生成,并分泌更多的生长因子以修复心肌功能,通过基因修饰加强营养因子、细胞活素或其受体的表达,可使其在梗死心肌有效存活、归巢和动员。MSC 超表达的CXCR4 与其配体SDF-1 结合后可增强移植和再生能力,并促进心肌壁的血管生成,降低胶原Ⅰ/Ⅲ比率以减少重塑[7-8]。类似地,SDF-1 超表达的MSC可保护受体心肌细胞并提供营养支持。相比于原始MSC 移植,超表达CXCR-4和SDF-1 的MSC 在治疗冠脉闭塞再灌注损伤小鼠时有更强的迁移、局限和治疗作用。据Noiseux 等的研究[9],用绿色荧光蛋白(GFP)标记的Akt 超表达的鼠MSC 注入心梗模型鼠梗死区域后,追踪标记的GFP 早达3 d 就出现MSC 与受体心肌细胞融合的现象。据此,可见MSC是目前心梗治疗的新希望。

2.4 脑卒中

细胞替代疗法是治疗神经系统疾病的新选择,Kim 等[10]发现Ngn1 可诱导MSC 分化成神经元,分化的细胞可表达电压门控L-型钙通道和河豚毒素敏感型电压门控钠通道,这2 条通道可激发并传播神经元。Ngn1 基因修饰的MSC 移植入脑卒中大鼠模型颅骨内后可促进神经元间接触,提高传导功能。研究还发现人端粒酶逆转录酶修饰hMSC 可用于大鼠脑缺血模型的功能恢复[11],修饰后的hMSC 由静脉注入中脑动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的大鼠模型,12 h后观察发现脑梗死面积明显减少,且鼠临床表现也明显改善。MSC 还可通过分泌如脑衍生神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)这类神经调节分子,促进神经细胞存活和神经形成[12]。为进一步增强其旁分泌作用,Kurozumi等[13]通过腺病毒载体将BDNF基因整合到hMSC 中,观察发现BDNF 的分泌量是未进行基因整合的MSC 的23 倍。目前的研究结果均说明通过不同方式修饰的MSC 作为一种治疗脑卒中的新方法,可减少梗死面积并促进脑缺血的功能恢复。

2.5 帕金森病

帕金森病主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性死亡,由此而引起纹状体DA 含量显著性减少而致病。而MSC 在一定诱导条件下可分化成神经细胞,基因修饰的MSC 更可持续翻译出治疗性蛋白,用于治疗神经退化性疾病。早期Schwarz 等[14]通过体内外实验均验证了基因修饰的MSC 治疗6-羟基多巴胺诱导的帕金森模型鼠的有效性,通过逆转录病毒转导酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因到MSC内,翻译的TH可使酪氨酸转变成L-多巴,且在鼠纹状体内检测到了L-多巴及其代谢产物。以上研究均表明基因修饰的MSC是治疗帕金森病的最优细胞治疗方案。

2.6 骨骼、肌肉系统疾病

转化生长因子β(TGF-β)超家族成员骨形态发生蛋白(BMP)修饰的MSC在形成骨和软骨过程中发挥重要作用。在骨缺陷的动物实验[15]及胫骨骨折不愈、脊柱融合术和骨不连的临床试验[16]中,均证明了BMP-2 的成骨作用。基因修饰的MSC 不仅可分化成肌肉骨骼细胞,还可刺激临近细胞参与修复,移植MSC到重度免疫联合缺陷的小鼠模型的胫前肌或关节中,短期表达BMP-2 就可有效诱导骨软骨形成。结合基因的治疗作用更优于整合基因,BMP-2/7和BMP-4/7 异二聚体比同型二聚体有更好的活性,同时转导BMP-2 或BMP-4和BMP-7 进入MSC 的成骨作用是简单基因整合的2~3 倍[17-18]。有研究发现,通过调节过表达成骨转录因子Runx2可控制MSC的成骨分化[19],这能够避免由BMP 过表达引起的异常成骨。基因修饰MSC 是骨软骨疾病的新型治疗方法,且通过调节表达系统可防止成骨的过表达。

2.7 癌症

基因修饰的MSC 可在肿瘤靶向治疗中发挥抗肿瘤作用,在癌症治疗方面有不可预期的前景。研究提出γ干扰素(IFN-β)通过抑制增生、促进凋亡起抗癌作用,但IFN-β的抗肿瘤浓度高于人体可耐受的最大剂量,而导致实验失败。为解决此问题,Studeny 等[20-21]通过静脉注射表达IFN-β的MSC 到重度免疫联合缺陷小鼠体内,治疗肺多发转移肿瘤,可见MSC 定位于肺肿瘤组织,抑制肺代谢并延长小鼠生存时间。Xin 等[22]研究表明,CX3CL1 超表达的MSC 也可起相同的作用。Nakamizo 等[23]进一步研究了表达IFN-β的MSC治疗颅内神经胶质瘤裸鼠的方案,发现MSC 定位于神经胶质瘤部位,亦明显延长小鼠存活时间。在Stagg 等[24]的类似研究中,探索了表达白细胞介素2(IL-2)的MSC 能否抑制免疫系统正常的低免疫原性B16 黑色素瘤小鼠的免疫反应,结果表明,表达IL-2 的MSC 与B16 细胞混合后可抑制肿瘤增生,且抑制作用与IL-2 的剂量成正比,对肿瘤的抑制率达90%,有效抑制B16 细胞的增生;但移植原始MSC 的对照组不影响肿瘤生长。通过不同方式的基因修饰均可达到治疗癌症的目的。

3 结语

临床上的持久难愈疾病及不断出现的新危险因素都给病人及医生带来巨大挑战,寻找新的治疗方法刻不容缓。基因修饰的MSC 在临床疾病治疗中有多潜能作用,通过合适的修饰,增强基因表达,使移植后的干细胞在宿主环境中可以存活更久,并分泌对病人有利的特定蛋白,起到治疗疾病的目的。但将细胞替代疗法应用于临床实践是一个巨大的挑战,目前迫切要解决的问题是如何精确地改良干细胞,翻译出特定蛋白质,有效用于疾病治疗。

[1]Friedenstein A J,Piatetzky-Shapiro I I Petrakova K V.Osteogenesis in transplants of bone marrow cells[J].Embryol Exp Morphol,1966,16(3):381-390.

[2]Wakitani S,Nawata M,Tensho K,et al.Repair of articular cartilage defects in the patello-femoral joint with autologous bone marrow mesenchymal cell transplantation:three case reports involving nine defects in five knees[J].Tissue Eng Regen Med,2007,1(1):74-79.

[3]Henkens T,Papeleu P,Elaut G,et al.Trichostatin A,a critical factor in maintaining the functional differentiation of primary cultured rat hepatocytes[J].Toxicol Appl Pharmacol,2007,218(1):64-71.

[4]Snykers S,Vanhaecke T,De Becker A,et al.Chromatin remodeling agent trichostatin A:a key-factor in the hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells derived of adult bone marrow[J].BMC Dev Biol,2007,7:24.

[5]Shahbazian M D,Grunstein M.Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation[J].Annu Rev Biochem,2007,76:75-100.

[6]Li Y,Zhang R,Qiao H,et al.Generation of insulin-producing cells from PDX-1 genemodified human mesenchymal stem cells[J].J Cell Physiol,2007,211(1):36-44.

[7]Cheng Z,Ou L,Zhou X,et al.Targeted migration of mesenchymal stem cells modified with CXCR4 gene to infarcted myocardium improves cardiac performance[J].Mol Ther,2008,16(3):571-579.

[8]Zhang D,Fan G C,Zhou X,et al.Over-expression of CXCR4 on mesenchymal stem cells augments myoangiogenesis in the infarcted myocardium[J].Mol Cell Cardiol,2008,44(2):281-292.

[9]Noiseux N,Gnecchi M,Lopez-Ilasaca M,et al.Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation[J].Mol Ther,2006,14(6):840-850.

[10]Kim S S,Yoo S W,Park T S,et al.Neural induction with neurogenin1 increases the therapeutic effects of mesenchymal stem cells in the ischemic brain[J].Stem Cells,2008,26(9):2217-2228.

[11]Honma T,Honmou O,Iihoshi S,et al.Intravenous infusion of immortalized human mesenchymal stem cells protects against injury in a cerebral ischemia model in adult rat[J].Exp Neurol,2006,199(1):56-66.

[12]Crigler L,Robey R C,Asawachaicharn A,et al.Human mesenchymal stem cell subpopulations express a variety of neuroregulatory molecules and promote neuronal cell survival and neuritogenesis[J].Exp Neurol,2006,198(1):54-64.

[13]Kurozumi K,Nakamura K,Tamiya T,et al.BDNF gene-modified mesenchymal stem cells promote functional recovery and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model[J].Mol Ther,2004,9(2):189-197.

[14]Schwarz E J,Alexander G M,Prockop D J,et al.Multipotential marrow stromal cells transduced to produce L-DOPA:engraftment in a rat model of Parkinson disease[J].Hum Gene Ther,1999,10(15):2539-2549.

[15]Oreffo R O.Growth factors for skeletal reconstruction and fracture repair[J].Curr Opin Investig Drugs,2004,5(4):419-423.

[16]McKay W F,Peckham S M,Badura J M.A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2(INFUSE Bone Graft)[J].Int Orthop,2007,31(6):729-734.

[17]Zhao M,Zhao Z,Koh J T,et al.Combinatorial gene therapy for bone regeneration:cooperative interactions between adenovirus vectors expressing bone morphogenetic proteins 2,4,and 7[J].Cell Biochem,2005,95(1):1-16.

[18]Franceschi R T.Biological approaches to bone regeneration by gene therapy[J].Dent Res,2005,84(12):1093-1103.

[19]Gersbach C A,Le Doux J M,Guldberg R E,et al.Inducible regulation of Runx2-stimulated osteogenesis[J].Gene Ther,2006,13(11):873-882.

[20]Studeny M,Marini F C,Champlin R E,et al.Bone marrowderived mesenchymal stem cells as vehicles for interferon-be-ta delivery into tumors[J].Cancer Res,2002,62(13):3603-3608.

[21]Studeny M,Marini F C,Champlin R E,et al.Mesenchymal stem cells:potential precursors for tumor stroma and targeteddelivery vehicles for anticancer agents[J].Natl Cancer Inst,2004,96(21):1593-1603.

[22]Xin H,Kanehira M,Mizuguchi H,et al.Targeted delivery of CX3CL1 to multiple lung tumors by mesenchymal stem cells[J].Stem Cells,2007,25(7):1618-1626.

[23]Nakamizo A,Marini F,Amano T,et al.Human bone marrowderived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas[J].Cancer Res,2005,65(8):3307-3318.

[24]Stagg J,Lejeune L,Paquin A,et al.Marrow stromal cells for interleukin-2 delivery in cancer immunotherapy[J].Hum Gene Ther,2004,15(6):597-608.

猜你喜欢
基因修饰成骨干细胞
干细胞:“小细胞”造就“大健康”
经典Wnt信号通路与牙周膜干细胞成骨分化
首个基因修饰有袋类动物培育成功
Nurr1基因修饰胚胎中脑神经干细胞移植治疗帕金森病
造血干细胞移植与捐献
干细胞产业的春天来了?
糖尿病大鼠Nfic与成骨相关基因表达的研究
骨形态发生蛋白4基因修饰的脂肪来源干细胞复合藻酸钙凝胶支架修复关节软骨的实验研究
液晶/聚氨酯复合基底影响rBMSCs成骨分化的研究
30例Ⅰ型成骨不全患者股骨干骨折术后康复护理