microRNA-21在老年肝细胞癌中的表达及临床意义

陆振华，周亚星

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，其中80%～90%为原发性肝细胞肝癌，全世界每年大约有1 000 000人死于肝癌，其中老年人是高发人群[1]。目前认为，肝癌最主要是由病毒感染所致[2]。当前，肝癌的发病机制尚未十分明了，人们普遍认为抑癌基因的异常失活或癌基因的激活是导致肝癌发生的主要原因。microRNA(miRNA)是一类新近发现的长度为17～25个核昔酸的非编码小分子RNA。研究发现，miRNA在肿瘤致病过程中起着及其重要的调节功能，且其与肿瘤分化有密切关系[3]。miRNA-21是较早发现的的人类miRNA之一，其在胰腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤血浆中明显上调，但是，miRNA-21在原发性肝细胞癌患者组织以及血浆中的报道尚少。本研究对比了miRNA-21在老年肝细胞癌及对应癌旁组织与乙肝肝硬化患者中的表达，分析其在肝细胞癌中的表达水平及其与临床病理特征的联系，探讨其在老年肝细胞癌诊治及预后方面的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 所有组织来源于2011年8月至2013年8月期间在泰州市人民医院治疗的老年患者的手术切除标本。其中，研究组30例，其中男13例，女17例，年龄62～78岁，平均年龄(68.12±7.20)岁。HbsAg均为阳性，术前均未经任何介入或化疗等任何处理，所有患者均接受肝癌根治性切除手术处理，所有组织标本经术后病理学证实为肝细胞癌，分别取肝癌及对应癌旁组织待用。HCC组织根据Edmondson标准分级：Ⅰ级8例；Ⅱ级12例；Ⅲ级10例；Ⅳ级10例。对照组为同期乙肝肝硬化患者30例，其中男15例，女15例，年龄64～79岁，平均年龄(69.23±7.16)岁，HbsAg均为阳性，经病理诊断为肝硬化。两组的性别、年龄等临床资料相比差异无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。所有标本于术中离体30 min内取材，经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋、切片备用。

1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒Trizol购于Gibco公司；逆转录试剂盒购于Femantes公司；DNA Marker、PCR试剂盒、焦碳酸二乙脂(DEPC)均购于生兴生化科技(南京)有限公司。miRNA-21及U6内参的引物均由广州锐博生物科技有限公司设计并提供。

1.3 组织及血浆标本总RNA提取及逆转录反应 研究组术中取肝癌及对应癌旁组织；对照组取肝硬化组织。此外，清晨空腹时抽取各研究对象的外周静脉血5 ml，加入EDTA抗凝剂，2 h内予高速离心，离心条件为：4 ℃，4 000 g，5 min。离心后提取上层血浆置EP管中放入-80 ℃保存备用。取约100 mg组织或250 μl血浆，加入1 ml Trizol，充分匀浆，抽提总RNA，所得RNA溶于20 μl DEPC处理水。提取的总RNA经紫外分光光度计进行定量及检测纯度。进一步用Femantes逆转录试剂盒进行逆转录，cDNA产物-20 ℃保存备用。PCR反应条件：95℃变性20 s，然后60℃ 20 s和70℃ 1s进行40个循环。

1.4 统计学分析 所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析，本组资料以表示，组间比较采用t检验，相关分析采用Spearman相关分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织及对应癌旁以及乙肝肝硬化组织中miRNA-21的表达水平 具体数据见表1。由表1可见，与乙肝肝硬化组织比较，miRNA-21在癌旁组织中的mRNA表达水平显著增高，差异有统计学意义(t=15.72，P<0.05)；与癌旁组织比较，miRNA-21在肝癌组织中mRNA的表达水平显著增高，差异有统计学意义(t=9.66，P<0.05)。

表1 肝癌及对应癌旁及乙肝肝硬化组织中miRNA-21 mRNA的表达水平

2.2 肝癌以及乙肝肝硬化患者血浆中miRNA-21 mRNA的表达水平 具体数据见表2。由表2可见，miRNA-21在肝癌患者血浆中mRNA表达水平显著高于乙肝肝硬化患者，差异有统计学意义(t=17.98，P<0.05)。

表2 肝癌患者以及乙肝肝硬化患者血浆中microRNA-21 mRNA的表达

2.3 肝癌组织及血浆中miRNA-21表达水平与肝癌组织病理分级的相关性 进一步采用相关分析结果显示肝癌组织中miRNA-21 mRNA表达水平与HCC分化程度显著正相关(r=0.685，P<0.05)，而肝癌患者癌旁组织中miRNA-21 mRNA表达水平与与HCC分化程度均无显著相关(r=0.125，P>0.05)，见表3。血浆中miRNA-21 mRNA表达水平与HCC分化程度显著正相关(r=0.603，P<0.05)，见表4。

表3 组织中miRNA-21 mRNA表达强度与HCC分化程度的关系

表4 血浆中miRNA-21 mRNA表达强度与HCC分化程度的关系

3 讨论

miRNA广泛的存在于组织、血浆或血清以及其他体液中，由于不易被内源性的核糖核酸酶所降解，其在体内表达比较稳定。研究发现miRNA既具有抑癌基因又具有癌基因的特性，其可对一系列重要的抑癌或者促癌基因的起着重要的调控作用[4]。研究发现miRNA-21与乳腺癌、胰腺癌、肺癌、多形性恶性胶质瘤、胃癌、结直肠癌等存在高度相关性，在恶性肿瘤中起着癌基因的重要功能[5-7]。进一步说明了miRNA-21在多种恶性肿瘤的发生、发展以及预后中具有及其重要的作用。

原发性肝细胞癌的发生发展是一个涉及到多基因、多通路、多步骤的复杂过程。一般认为导致肝癌发生的主要原因为抑癌基因的异常失活或者致癌基因的激活，然而其具体机制尚不清楚。本研究通过检测miRNA-21在老年肝癌患者肝组织及对应癌旁组织中的表达发现，miRNA-21在肝癌组织中的表达水平均显著高于对应的癌旁组织以及肝硬化患者，其在肝癌组织中的表达与肝癌Edmonson分级显著相关。此外，患者血浆中miRNA-21表达水平亦与肝癌的临床分期显著正相关，均说明了miRNA-21在肝癌患者癌组织以及血浆中的表达程度与肝癌的细胞的增殖能力和恶性程度有着密切的联系，从而提示了miRNA-21在肝癌的诊断、分级以及预后评价可能起着重要的作用。Meng等[8]在分析肝癌组织表达谱时发现miRNA-21较对照组显著上调，并从体外实验进一步发现miRNA-21能增强肝癌细胞的增殖及侵袭能力，这与本研究研究结果一致。

综上所述，miRNA-21在肝细胞癌的发生、发展中起着重要的作用，老年肝癌患者癌组织以及血清中miRNA-21的检测对于对患者临床个体化治疗以及预后可能具有一定的指导意义。

参考文献：

[1] Ferenci P,Fried M,Labrecque D,et al.Hepatocellular carcinoma (HCC): a global perspective[J].J Clin Gastroenterol,2010,44:239-245.

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[3] Lu J,Getz G,Miska EA,et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers[J].Nature,2005,435(7043):834-838.

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[8] Meng F,Henson R,Wehbe-Janek H,et al.MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer[J].Gastroenterology,2007,133(2):647-658.