霉菌毒素吸附剂与解毒剂的研究进展与评价

■刘少文 柏 凡 郭春华 柏 雪 张正帆 彭忠利 方思敏

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041；2.农业部饲料质量监督检验测试中心（成都），四川成都610041）

霉菌毒素是霉菌在生长繁殖过程中产生的有毒次级代谢产物，毒性极强，能抑制机体免疫、抑制造血，对肝脏和肾脏造成较大危害[1]。全球每年因霉菌毒素造成的损失达数百万美元[2]。因此，如何消除霉菌毒素的潜在威胁成为当前饲料研究领域的热点之一。自20世纪90年代，畜牧业开始利用饲料霉菌毒素吸附剂如硅铝酸盐类、酯化甘露聚糖等去除霉菌毒素，取得了一定的效果。但这类吸附剂容易吸附其他营养元素并造成环境蓄积性污染。本世纪初，利用微生物及产物酶来降解饲料霉菌毒素引起广泛关注，但这类解毒剂也存在一系列问题尚未解决。如一些次级代谢产物可能有毒害作用，绝大多数微生物解毒机理尚不明确。目前市场上这两类产品都存在良莠不齐的问题，原因之一就是没有相关的国家标准来对其进行评价。因此，建立霉菌毒素解毒剂和吸附剂的评价标准迫在眉睫，这对规范市场和指导用户消费十分重要。

1 霉菌毒素吸附剂

1.1 硅铝酸盐类(HSCAS)吸附剂

HSCAS类吸附剂主要有：黏土、膨润土、蒙脱石、沸石、水合硅铝酸盐等。它是利用强大的比表面积与静电吸引力吸附有离子极性的霉菌毒素，具有一定的选择性。研究发现，HSCAS对黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）有较好的吸附能力[3]。Shebl等[4]在1日龄罗斯鸡日粮中同时添加0.2%的HSCAS和211.88 μg/kg的AF，结果检测到AF残留显著减少，且肝脏中不正常染色体数目比不添加HSCAS的AF饲料下降20%。Nuryono等[5]在体外试验中也发现，膨润土和沸石可以吸附99%AFB1。但HSCAS类吸附剂对玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、赭曲霉毒素A（Ochratoxin，OTA）、单端孢类毒素(Trichothecenes)等吸附效果不理想，同时也会吸附饲料中其他营养物质[6]。研究发现，对此类产品进行改性，可以提高其毒素吸附力，减少对营养素的吸附。

1.2 酵母提取物

酵母提取物主要是指酵母细胞壁的提取物，包含β-葡聚糖、甘露寡糖、糖蛋白、脂类等。酵母细胞壁中的这些功能性碳水化合物可以通过氢键、离子键等结合多种霉菌毒素。Girgis等[7]发现，高分子葡甘聚糖作为霉菌毒素吸附剂时，不仅对呕吐毒素(Deoxynivalenol,DON)和ZEN有一定吸附作用，而且对肉鸡免疫功能有一定调节作用；Diaz-Llano等[8]证明葡甘聚糖吸附剂对采食了镰刀霉菌毒素（Fusarium）污染饲粮的妊娠母猪有一定解毒作用，但Leung[9]在猎犬上和Chowdhury等[10]在蛋鸡上得到的结果却相反。Faixová等[11]利用改性葡甘聚糖作肉鸡霉菌毒素吸附剂，发现它对ZEN有很大的清除作用，但在断奶仔猪上效果可能不太明显[12]。

1.3 活性炭

活性炭是一种多孔不溶性粉末状物质，含有大量微孔，比表面积可达500～3 500 m2/g[13]。活性炭在体外试验中对霉菌毒素具有较好的吸附解毒作用。体外试验发现，2%活性炭可将肠道内DON的吸收率从51%降低到28%，对瓜蒌镰菌醇(NIV)吸收率从21%降低到12%[14]。但在体内试验中却得到不同的结论，这可能是由于活性炭不是选择性吸附，易造成吸附饱和的原因[15]。在利用活性炭作霉菌毒素吸附剂时应谨慎使用。例如，添加活性炭会不同程度地使饲料变黑，影响商业价值，同时饲料中维生素、矿物元素等也会被一定程度的吸附。

1.4 其他吸附剂

除上述几种常见的吸附剂外，一些新的霉菌毒素吸附剂不断被发现，如消胆胺(Cholestyramine)、交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)和酯化萄甘露聚糖(EGM)等[16]。这类新型饲料霉菌毒素吸附剂可缓解霉菌毒素对动物机体造成的不良反应，并提高动物生长性能，能够将饲料中营养成分和药物的吸附降到最低。

2 霉菌毒素吸附剂的评价

市场上的霉菌毒素吸附剂形式多样。然而，至今还未发现某一种吸附剂对所有霉菌毒素都有较好的吸附效果。另外，霉菌毒素吸附剂还存在一系列问题尚未解决。如动物将吸附剂吸附的毒素排出体外会污染环境，吸附剂过量添加会影响生产性能。因此，我们迫切需要一种合理的霉菌毒素脱毒剂评价方案。

2.1 方法选择

霉菌毒素吸附剂的评价应包括体外试验和体内试验。

2.1.1 体外试验

体外试验可以作为评价霉菌毒素吸附剂的第一步，通常按照下列步骤进行：A、吸附试验：①配制霉菌毒素标准液并加入一定量的待测吸附剂。②寻求最适反应pH值和温度。pH值范围较广，一般在3～8之间，其中pH值为7时应用较多；温度为20～(37±1)℃，国内研究者大多将温度设置在(37±1)℃，而国外学者大多设置温度为室温；振荡反应1 h后2 000～1 000 r/min下离心10 min。③测定上清液中霉菌毒素的含量。测定方法有薄层层析法（TLC）、色谱法、免疫化学检测法（主要是ELISA法）以及高效液相色谱法(HPLC)等。根据吸附前后的霉菌毒素浓度差可以计算出该吸附剂的吸附率。B、解吸试验：待吸附反应结束后，倾去离心管上清液，沉淀中加入一定量的水溶液，pH值约为6.8，摇床振荡解吸1 h，然后在一定转速下离心，测定上清液中霉菌毒素的含量，计算出解吸率[17]。然而，体外实验并不能代表动物体内复杂的理化环境，因此在体外实验后还应该进行体内试验对其研究评价。

2.1.2 体内试验

进行动物饲养试验。在动物霉变日粮中添加吸附剂饲喂动物一段时间，考察生产性能，如死亡率、采食量、体增重和饲料转化效率等，再进一步检测吸附剂对霉菌毒素造成的组织损失的改善效果，如反映免疫功能的血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB），反映肝脏功能和蛋白质代谢的尿酸（UA）、谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶(GPT)、淀粉酶(AMY)、碱性磷酸酶(ALP)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)酶活和反应应激氧化功能的NO含量、超氧化物歧化酶(SOD)酶活等血液生化指标；组织病理切片；淋巴细胞凋亡情况等。同时还应对畜产品中霉菌毒素的残留量和粪便中霉菌毒素的排出量进行检测，以此来整体评价霉菌毒素的吸附效果。如Raymond等[18]分别用自然霉变日粮和添加0.2%酵母细胞壁的霉变饲粮饲喂母马，3周后发现添加0.2%酵母细胞壁组较霉变日粮组母马采食量和日增重极显著提高(P=0.004)，血清中γ-谷氨酰转移酶活性极显著下降(P＜0.01)，IgG、IgA和IgM无显著差异。

2.2 评价指标

评价指标包括吸附的广谱性与专一性、稳定性、耐受性和安全性等。①广谱性与专一性。理想的吸附剂具有广谱的霉菌毒素吸附特性，现有的吸附剂一般只针对某一类霉菌毒素，如HSCAS类吸附剂对AFT吸附能力最强，而对ZEN、OTA吸附较弱。理想的吸附剂同时不能吸附饲料中任何营养成分，如维生素、氨基酸等[19]。②稳定性。理想吸附剂具备热稳定性、酸碱稳定性、耐储藏的特点，某些改性后的吸附剂要保证自身物理性质稳定，不随环境改变而大幅度破坏自身结构，否则失去改性意义。③耐受性。过去认为吸附剂一般对动物没有明显毒性，但最近研究表明，动物对于吸附剂仍有一定耐受剂量，超过剂量则有负面影响。如杂交鲟对蒙脱石的耐受剂量一般为2.5%，超出此范围，将会导致肝血窦腔隙明显增大，肝脏实质组织溶解[20]；奶牛日粮中蒙脱石的推荐添加量为0.5%，超出安全限量，则会降低生产性能[21]；羊日粮中HSCAS超过2%会降低饲料中镁、锰和锌的生物利用率[22]。④安全性。安全性评价应该满足两点：吸附剂自身安全性和对环境的安全性。吸附剂在生产过程中要减少和避免重金属的污染，动物排泄出来的吸附剂-霉菌毒素复合物能快速被微生物降解，且不产生有毒产物。

以上研究方法表明，可以通过体外试验和体内试验以及动物的生理指标来评价霉菌毒素吸附剂，为了对其作出更深入的评价，还应测定吸附剂的各类特性，如果吸附剂对霉菌毒素的吸附效果良好，那么这类特性应符合上述指标。

3 霉菌毒素生物解毒剂

霉菌毒素生物解毒剂是指可以降解霉菌毒素的微生物、中草药或酶制剂，它能将霉菌毒素彻底分解成无毒物质，不会对环境造成负面影响。目前，国内外报道已有上千种微生物可以降解饲料中的霉菌毒素，市面上也出现了各类商品化的解毒产品。

3.1 真菌解毒剂类

早在20世纪80年代，人们就发现了真菌可以去除霉菌毒素。如部分霉菌和部分食用真菌能降解黄曲霉毒素（Aflatoxin,AFT）。酿酒酵母经热处理后对赭曲霉毒素（Ochratoxin,OTA）的解毒能力会优于活细胞，是一类应用价值较大的生物脱毒剂之一[23]。Molnar O等[24]从白蚁肠道中分离到毛孢子菌属（Trichosporon）中的一个成员，该菌株可在24 h内将玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)降解成CO2或者其他无毒代谢物。此外能够降解霉菌毒素的真菌类微生物（包括产物酶）还包括：胶红类酵母菌（Rhodotoruia glutinis），曲霉菌属（Aspergillus sp.）中的黄曲霉、寄生曲霉、少根曲霉等，茎点霉菌属（Phoma sp.）和孢霉（Dactyliumdendroide），食用真菌糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）和假密环菌（Armillariella tabescens）[25-26]。

3.2 细菌解毒剂类

许多益生菌或其代谢产物能抑制霉菌生长，解除毒素或使毒素合成量显著减少。Sezer[27]将乳酸菌（Lactobacillus）和乳酸菌素与AFB1混合后培养，通过PCR方法确认细菌与细菌素的存在，经ELISA试剂盒检测AFB1的浓度，发现AFB1下降90%。然而，目前国内外对细菌生物降解AFT的报道并不多见，主要有橙色黄杆菌(Flavobacterium aurantiacum)、分支杆菌(Mycobacterium fluoranthenivorans)和红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)[28]。Bakutis B 等[29]分离出的胶红类酵母菌（Rhodotorula glutinis）可将玉米饲料中的ZEN毒素在10 d内从2.20 mg/kg降至0.30 mg/kg。此外，能够生物降解霉菌毒素的细菌[30]（包括产物酶）还有：橙红色黏球菌（Myxococcus fulvus）、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）、炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、纤维菌（Cellulosimicrobiumsp.）、短波单胞菌（Brevundimonas sp.）、小诺卡氏菌(Nocardiaasteroides)等。

3.3 解毒酶

某些微生物代谢产生的酶能有效分解霉菌毒素。但由于微生物降解酶的分离纯化过程复杂、机理不明确、酶的活性不稳定、酶作用条件苛刻等原因，这类脱毒剂还较难应用于实际生产。目前，主要的高效解毒酶类型有蛋白水解酶、内酯水解酶和氧化酶等[31]。不同来源的解毒酶降解效率不相同，例如，来源于白腐真菌的真菌漆酶和来源于真菌假密环菌的AFT解毒酶（ADTZ），能够降解AFT，降解率分别为55%[32]和22.52%[33]。近年来解毒酶是较为热门的研究领域，利用基因工程技术生产解毒酶将是未来发展方向之一。

3.4 植物提取物

植物及其提取物对霉菌生长也具有抑制作用，如菊花脑挥发油对霉菌菌丝生长有抑制作用，菌株培养前2 d几乎没有生长，此后生长缓慢[34]；严赞开分别用浓度为0.062 5%、0.125%、0.25%、0.50%、1.0%、2.0%和4.0%的生姜提取物对霉菌生长进行抑菌试验，结发现当浓度为3.0%时,生姜提取物对所有菌株的生长抑制作用最强，说明其具有广谱抑菌性[35]；同时有研究表明，金银花对饲料中霉菌也有一定抑制效果[36]。

4 霉菌毒素解毒剂的评价

霉菌毒素解毒剂同霉菌毒素吸附剂一样，也应同时进行体外和体内试验，方法与吸附剂相同。

4.1 解毒微生物的评价

近年来，越来越多的微生物被发现可以降解饲料中的霉菌毒素，这些微生物的安全高效性可从以下几方面进行合理评价：①菌株的安全性。这是至关重要的评价指标，虽然任何菌株的安全性都是相对的，但作为霉菌毒素解毒剂时，不应该产生任何有毒代谢产物[37]。②菌株的高效性。理想的霉菌毒素降解菌株是高效、环保和易保存的。赵丽红等从健康鱼肠道中分离筛选到1株黄曲霉毒素降解菌（霉立解菌，MLJ060菌），其发酵液对AFB1降解率达 81%，每升MLJ060菌发酵液干燥后可得到0.9 g干物质，其中活菌含量约为1×109CFU/g[38]。③生物工程菌的安全性。基因修饰前后的生物工程菌在病理学、毒理学或致敏性方面都应该是安全的，这是必要的评价指标。必须考虑基因工程改造可能给原有菌株的内源基因表达造成影响，基因组的变化可能导致包含产生毒素信息的基因表达的增强,或者改变某些生物分子合成或代谢酶的基因表达[39]。

4.2 解毒酶的评价

解毒酶的酶活不稳定、酶作用条件苛刻限制了其应用范围。因此，研究者需从多方位评估霉菌毒素解毒剂。以下几点是评估方案中不可缺少的：①解毒酶的安全性。理想的解毒酶是安全、高效,对饲料无污染、有高度的选择性。英国化学毒性委员会(COT)建议微生物解毒酶至少要做90 d的老鼠喂养试验，并以高标准进行生物分析。COT认为菌种改良是必要的，但每次改良后应作生物安全检测[40]。②产物的安全性。毒素降解后应该被破坏或转化成无毒化合物，且这种改变是永久性的[41]；同时产生的这些无毒化合物不可以影响饲料的营养价值和适口性。③降解酶的广谱性、高效性、专一性、稳定性以及酶活的宽适应性也是必要的评价指标。

5 小结

饲料受霉菌毒素的污染越来越严重，寻找合适有效的控制方法是畜牧业发展的当务之急。在饲料中添加霉菌毒素脱毒剂能有效减轻这种污染。然而，遗憾的是目前市场上还没有出现一种理想的脱毒剂符合生产要求。因此，除了对霉菌毒素脱毒剂进行研究外，建立一种快速、简便、有效、可行的霉菌毒素脱毒剂评价方案也是很有必要的。