益生菌在水产动物饲料中的应用及作用机制研究进展

■刘娜娜 刘长军 李红军 傅玲琳 王彦波

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310018；2.象山县水产技术推广站，浙江象山315700；3.杭州天农生物营养技术有限公司，浙江杭州311107）

益生菌的概念最早由Lilly和Stillwell提出，他们认为益生菌是由一种微生物产生的物质，并能够刺激另一种微生物的生长，这种作用与抗生素恰好相反。随后Parker（1974）将益生菌定义为能够平衡和促进肠道微生态的一类微生物，然而这个定义并没有很好地与抗生素区分。Fuller（1987）又对益生菌进行了描述，即它是一种活的微生物饲料添加剂，能够改善肠道菌群的平衡从而对宿主动物产生有益影响。Kozasa首次将益生菌应用于水产养殖中，使得益生菌更为广泛地被推广，其概念的外延也得到了扩展。目前，一般认为益生菌是一种活性微生物或微生物制剂，可以通过改善水产动物等宿主肠道内微生态平衡或调节宿主黏膜与免疫系统功能来提高宿主的免疫力，最终有利于宿主健康。常见的水产动物饲料中益生菌种类主要包括乳酸菌、芽孢杆菌、酵母等。

1 水产动物饲料中益生菌的应用概述

随着水产动物饲料中抗生素等化学药物的应用带来的负面作用日益突出，如何有效地提高水产动物的免疫力和对疾病的抵抗力成为水产养殖业可持续发展的关键和研发热点。由于具有使用安全和方便等优点，益生菌被逐渐应用于鱼类、甲壳类等水产动物饲料中，并取得了一定的成绩。如嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）应用于尼罗罗非鱼养殖中，结果发现，罗非鱼的生长及成活率都有所提高，并且可以显著抵抗病原菌海豚链球菌（Streptococcusiniae）的感染。剖析原因主要是由于嗜酸乳杆菌通过在细胞表面螯合元素铁，使得海豚链球菌无法利用铁，从而抑制了其生长繁殖。在甲壳类水产动物中，益生菌可以通过增强其免疫力来提高其成活率，如芽孢杆菌类制剂饲喂斑节对虾后，与对照组比较成活率显著升高，究其原因，与饲喂益生菌后斑节对虾血淋巴吞噬作用显著增强、体内酚氧化酶和抗菌活性显著提高，进而增强虾的细胞免疫和体液免疫竞争性排斥病原菌有关。此外，芽孢杆菌制剂饲喂凡纳滨对虾后同样发现其成活率显著升高，进一步研究表明，成活率的显著升高与此类芽孢杆菌改善凡纳滨对虾肠道内微环境、调节肠道中菌群的生长和平衡有关。由此可见，益生菌的作用方式并不固定，与动物种类、饲喂方式、菌种类别等均有关，从另一方面来讲这就增加了相关研究的难度。

尽管益生菌在水产动物饲料中得到了日益广泛的应用，但是目前仍然有许多问题需要进一步研究。如在定向筛选某种益生菌菌种时，要注意菌株的选育和培养条件对其特性的影响，这是因为即使对于同一种菌株，选育目标和培养条件不同，菌株诸如胞外活性物质的分泌能力、肠道中的稳定定植时间等也不尽相同。研究还证实，不能单纯根据益生菌在体外试验中得到的结果来预测其在水产动物体内的效果。如以大西洋鲑为研究对象，体外实验证实益生菌荧光假单胞菌具有显著拮抗有害菌杀鲑气单胞菌的作用，但是体内试验的结果却表明，对于由杀鲑气单胞菌引起的大西洋鲑感染病没有效果。所以，在水产动物饲料中应用的益生菌，应该根据具体的养殖动物和实际使用情况来定向筛选和研发，也只有这样益生菌才能发挥出其应有的效果。

2 不同品种水产动物饲料中益生菌的应用研究

近年来，不同品种水产动物（鱼类、甲壳类和其他水产动物）饲料中益生菌的应用研究参见表1。由表1可见，尽管益生菌菌株各异，但是绝大多数研究表明在饲料中添加和使用，均可以显著改善水产动物的免疫和生长性能，提高对于病原微生物的抵抗力，降低死亡率，最终改善生产性能，这也是益生菌在水产动物饲料中应用日益广泛的直接原因。同时在应用过程中也要注意益生菌的用量、稳定性和使用方式，以及针对不同的水产动物研究制定包括使用最佳时间和用量等在内的相应配套的应用规范和标准，避免盲目的应用导致的益生菌失效。

3 水产动物饲料中益生菌的作用机制

3.1 产生抑菌和抗菌物质

益生菌在自身生长繁殖过程中会产生细菌素等代谢产物，这类具有抑菌活性的蛋白质或小肽对于产生菌本身没有作用，但是可以通过其特有的方式抑制或者拮抗其他菌株，一种方式是通过结合脂质Ⅱ（糖肽亚基在细胞壁和细胞质之间的主要载体）阻止细胞壁的合成而导致细胞死亡；另一种方式是脂质Ⅱ插入到细胞膜中形成孔道，使细胞膜发生去极化和三磷酸腺苷（ATP）泄露，而此时胞外的水分子进入细胞导致细胞发生自溶而死亡，如乳酸链球菌素（Nisin）就采用此类抑菌方式。此外，还有一类热稳定小肽类非羊毛硫细菌素，也是通过膜透化作用而引起胞内物质泄漏并最终导致细胞死亡。而对于大分子溶菌蛋白如葡萄球菌溶菌素（Lysostaphin），则通过作用于目标抑制/拮抗菌的细胞壁，从而导致细胞壁的溶解和最终的细胞死亡。

3.2 竞争营养物质以及黏附位点

益生菌可通过与病原菌竞争营养物质，形成“优势菌群”，从而抑制病原菌的生长繁殖。如细菌在生长过程中需要铁，而铁在动物体液和组织中的量是有限的且是多以不溶解的Fe3+存在。荧光假单胞菌作为益生菌可以通过分泌铁载体，提高对铁的利用率进而与病原菌鳗弧菌争夺游离的铁离子，最终达到抑制该菌生长的目的。益生菌通过黏附、定植在水产动物肠道黏膜上，并形成一层厚的菌群膜，通过这种方式与病原菌竞争黏附位点和营养物质，而形成的菌群膜可以阻止病原菌的入侵，进而达到抑制病原菌的作用。研究表明，参与与病原菌竞争黏附位点的主要是益生菌的S-层蛋白、脂磷壁酸和胞外多糖等。如乳酸菌的S-层蛋白含有大量的疏水性氨基酸，不易被水等溶剂溶解，因此有助于乳酸菌与病原菌竞争黏附位点，此外乳酸菌的胞外多糖可作为宿主配体或病原菌凝集素，对某些细菌在肠上皮细胞黏附过程中产生一定的屏障作用，可以导致病原菌因不能黏附在宿主细胞上而缺少生长空间死亡。再如脂磷壁酸是益生菌双歧杆菌细胞外的主要疏水成分，能够在自身表面形成一种微毛结构，同时脂磷壁酸由于具有等电点低的特点，可使自身表面分布较多的负电荷，而双歧杆菌与受体细胞黏附的要点就是利用这种静电作用，因此可以与病原菌竞争黏附位点。

3.3 改善机体免疫功能

在水产动物养殖中，益生菌被作为饲料中免疫调节剂日益受到重视。在鱼类养殖中，益生菌可以刺激先天性免疫和细胞免疫，包括增加红细胞压积，增强吞噬细胞、溶菌酶、超氧化物歧化酶以及过氧化酶等的活性。对于虾类养殖来说，益生菌可以改善虾的肝体指数、酚氧化酶以及超氧化物歧化酶等活性，最终提高虾的免疫力和对疾病的抵抗力。近期研究表明，益生菌免疫调节的机制与动物肠道上皮细胞或某些特异肠道微生物有关。益生菌在进行免疫调节时先黏附于宿主肠道上皮细胞（IECs），然后靶向识别其表面的受体，进而开始一系列的免疫调节机制，其中包括调节细胞间信号核因子κB的功能、加强自然杀伤细胞的活力以及改善肠道微生态平衡。如益生菌嗜酸乳杆菌可增加结肠黏液细胞数量和黏蛋白数量，促进黏蛋白MUC2的表达进而稳定肠道屏障功能；而益生菌双歧杆菌可降低白介素（IL-6和IL-8）等促炎因子，进而降低肠道通透性以对肠道黏膜发挥保护作用。

表1 益生菌在鱼类饲料中的应用研究

3.4 促进营养物质的消化和吸收

益生菌在水产动物体内定植后可以产生消化酶，从而协同动物内源酶共同消化和降解饲料中的蛋白质、脂肪和碳水化合物等，促进宿主对营养物质的吸收和代谢，改善饲料的消化率和提高饲料利用率，最终促进动物生长发育。此外，大部分益生菌自身含有多种营养物质，例如光合细菌中含有较为丰富的蛋白质、维生素、钙、磷和辅酶Q10等，酵母中同样含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和微量元素，并含有消化酶和一些未知的生长刺激因子。此外，近期研究发现，益生菌可以通过与宿主细胞和肠道土著菌的相互作用，促进水产动物自身消化酶的分泌，相关机制还需要进一步的研究。

4 水产动物饲料中益生菌的应用前景

在广泛推广益生菌的同时，在水产动物饲料中应用也面临着现实的困惑，目前仍有许多研究者对益生菌菌株的安全性提出质疑，他们认为益生菌可能由于自身含有的一些条件性可编码致病性、耐抗生素基因而引发安全性事件，而且一旦存在这类基因，可以通过水平转移在菌间和菌外传播。随着现代分子生物学技术和检测手段的不断进步，益生菌菌株的全基因测序和分析成为了可能，随着基因谱图的不断研究和后基因组时代功能基因的剖析，这一问题将会被解决。尽管相关文献报道乳酸菌作为益生菌在水产动物饲料中是最常用的类别，但是研究发现，并不是所有的乳酸菌菌株都适合用作益生菌生产，需要综合考虑菌株的特性和生产的经济性。此外，目前随着保存时间的延长，益生菌菌株的数量或者活力均有所下降，造成了应用效果的不稳定，因此定向筛选技术和稳定保存技术也需要进一步研究，可结合分子遗传育种学和途径工程在菌株诱变和选育上更加突出针对性和功能性，可通过菌株理化特性和生化代谢分析，研发长期稳定保存过程中相应的保护剂或者保存技术。由此可见，水产动物饲用益生菌的研究是一个系统工程，需要借助于多学科的理论知识和现代先进技术的发展，旨在为可持续的水产养殖业提供一定理论和技术支撑，实现水产品的安全生产。

表2 益生菌在甲壳类动物饲料中的应用研究

表3 益生菌在其他水产动物饲料中的应用研究

（参考文献43篇，刊略，需者可函索）