小鼠原位肝移植操作技术改良进展

杨超，崔子林，张雅敏（.天津医科大学一中心临床学院，天津 3009；.天津市第一中心医院肝胆外科，天津 3009）

随着移植技术的不断进步，肝移植已经成为治疗终末期肝病的重要手段，对肝移植方面的相关研究也日益增多，因此，肝移植动物模型的建立也变得越来越重要，本文对近年来小鼠原位肝移植（OLT）模型建立的步骤改良及手术注意事项进行综述。

大鼠OLT模型是在1973年最先由Lee等［1］成功建立的，1979年Kamada等［2］提出的“双袖套管”方法使得大鼠OLT模型的建立更进一步发展，随着显微外科技术水平的提高，多种移植模型的建立得到广泛研究［3］。1991年，Qian等［4］在Kamada法的基础上首次成功建立小鼠OLT模型，从此各移植中心陆续开展了对小鼠肝移植相关技术的研究。与以大鼠为实验对象的研究不同，小鼠肝移植模型在移植免疫方面有着其独特的优势［5-6］。各种基因敲除［7］和转基因小鼠［8］模型的成功建立及大量特异性的单克隆抗体的出现［9］， 给肝移植后免疫学的研究带来了更为广阔的发展天地，与此同时，小鼠肝移植模型的成功建立就变得尤为重要。

1 Qian等［4］报道的经典小鼠OLT模型

Qian等［4］使用 B6AF1、C57BL/6、和 BALB/c近交系雄性小鼠，在4.0～6.4倍放大倍数的手术显微镜下，将小鼠固定，用甲氧氟烷麻醉，备皮消毒，取腹部正中切口，充分暴露手术视野，横断胆管，结扎幽门静脉、脾静脉、右肾上腺静脉和右肾静脉。由阴茎背静脉缓慢注射0.3 ml乳酸林格液溶解稀释的肝素（100 U）进行肝素化。在用动脉夹夹闭胸主动脉以及已经分离的接近膈肌的肝上下腔静脉（SHVC）后，用1 ml冷的乳酸林格液通过腹主动脉灌注肝脏，用冷的乳酸林格液频繁冲洗肝脏和周围的组织来保持肝脏低温，分离肝下下腔静脉（IHVC）至左肾静脉水平。

离断血管，取肝脏并放置在一个盛有冷的乳酸林格液的容器中，结扎胆囊管并摘除胆囊，IHVC和门静脉（PV）插入泰夫龙套管（IHVC用外径为1.7 mm的套管，PV用外径1.2 mm的套管）。

受体手术的麻醉、消毒与供体手术相同。以IHVC、PV、SHVC的顺序夹闭血管并离断。当移除肝脏后，将移植肝植入原位，用10-0尼龙缝线吻合SHVC。将移植肝PV套管插入已经切开前壁的受体PV并扎紧，移除SHVC和PV血管钳开放血管。用同样方法插入IHVC的套管，不做肝动脉重建，用长度超过4 mm的聚乙烯导管支架完成胆管连续性重建，用乳酸林格液补充术中失血，最后分两层连续缝合关腹。一次性肌肉注射5 mg头孢孟多酯钠和60 kU比西林，将小鼠放置在取暖灯下直到苏醒，随意进食和饮水。

2 小鼠OLT改良方法

在Qian等［4］成功建模的基础上，国内外许多学者成功复制了小鼠肝移植模型，并在其基础上进行了改良，现将部分成功建模的方法步骤综述如下。

通常使用的小鼠品系为C57BL/6、BALB/c和昆明小鼠等雄性小鼠，此外根据实验目的不同，可以使用基因工程改良后的小鼠。常用的麻醉方法为气体持续吸入麻醉，麻醉剂可选择乙醚、氯胺酮配合乙醚、异氟醚（又名异氟烷）等。麻醉前也可以皮下注射0.04 mg/kg的阿托品作为气体麻醉前的引导用药［10］。使用气体麻醉可以很好地控制麻醉药的剂量，特别是在受者手术无肝期的时候，可迅速、精确地调整剂量，维持稳定的麻醉状态。此外也可腹腔注射戊巴比妥钠（60 mg/kg）［10］和氯胺酮等麻醉药，但是受体在无肝期时候容易出现死亡，术后死亡率也较高。手术显微镜可以选用单人双目或双人双目显微镜；IHVC套管可采用6F动脉穿刺鞘管或7F动脉穿刺鞘管牵拉制成的导管或16G留置针鞘管；PV套管可采用6F动脉穿刺鞘管或5F动脉穿刺鞘管牵拉制成的导管或28G留置针鞘管；胆管支架可采用一次性硬膜外导管牵拉制成的导管或外径为0.61 mm聚乙烯套管加工制成的导管。

将小鼠固定，可使用聚维酮碘为腹部手术区域消毒［11］。为了使暴露更加充分，通常采取上腹全横切的切口，也可使用上腹部十字切口开腹。一个血管钳夹住剑突并向头侧牵拉固定，可根据切口不同选择2个或4个小拉钩，同时可以使用腰桥将受体背部垫高，以充分暴露手术视野。首先横断胆管，插入预先准备的胆管支架，结扎幽门静脉、脾静脉、右肾上腺静脉和右肾静脉，切断右肾上腺静脉时可采用电凝切断以减少术中出血［12］。于阴茎背静脉注射125 U/ml肝素生理盐水0.5 ml或在IHVC注入含肝素钠100 U的生理盐水0.4 ml进行肝素化［13］。灌注液可选择4 ℃乳酸林格液或4 ℃威斯康星大学保存液（UW液），有些研究表明，移植肝保存在UW液中18小时，不会产生显著的损伤和移植肝的衰竭［14］。灌注穿刺部位可选择下段腹主动脉，以30～10 ml/h的速度灌注2～3 ml灌注液；或者灌注穿刺部位选择PV，缓慢灌注4 ml灌注液；亦或选择腹腔干，通过输液泵以1.5 ml/min的速度缓慢灌注20 ml灌注液。肝脏和周围的组织通过用冷的乳酸林格液频繁冲洗来保持低温［15］。紧贴左肾静脉上方剪断IHVC，在脾静脉上方离断PV，在胆管支架下方离断胆总管，结扎并离断食管与肝脏之间的交通支；紧贴膈肌剪断SHVC，取下的肝脏放置在一个盛有冷的乳酸林格液的容器以备进一步处理。

供肝的修整通常选用类似Kamada大鼠OLT的“双袖套管法”修整肝脏，基本不采用“三袖套管法”。结扎胆囊管，摘除胆囊。

受体手术可通过腹部正中切口进腹或上腹全横切，充分暴露手术视野。结扎分离胆管、肝动脉、右肾上腺静脉，切断肝周韧带并且用结扎线绕过SHVC，用这根线来把肝脏和膈肌分开便于在SHVC放置一把Santinsky钳。在肝脏移除之前，在PV分叉处注入常温生理盐水0.2～0.3 ml，当准备移除肝脏时，以IHVC、PV、SHVC的顺序夹闭并离断血管。原位置入供肝，用10-0尼龙缝线吻合SHVC实现重建，具体可选择的方法有“一针法”外翻缝合或端端连续外翻缝合或双针连续水平褥式外翻缝合，前后壁均自左向右缝合。在闭合SHVC前排尽血管内气泡，袖套法吻合门静脉， 松开PV及SHVC止血夹，结束无肝期，无肝期时间要小于20分钟。同法吻合IHVC。将供体胆管支架置入受体胆总管内结扎固定，大网膜覆盖。

通常不做肝动脉重建，但也有学者进行肝动脉重建，其方法为分别在腹腔干上方及髂总动脉处分离一段腹主动脉，供肝的肝动脉与受体腹主动脉行端侧吻合，用已准备好的胆管支架插管固定来完成胆管连续性重建。用38℃生理盐水或甲硝唑冲洗腹腔，术中失血可选择经阴茎背静脉注射0.2 ml乳酸林格液，分两层连续缝合关腹。术后3小时灯照保暖，可不给予止痛、抗炎治疗，或者术后3天内腹腔注射头孢地嗪钠100 mg/（kg·d）或肌肉注射80 kU青霉素。单笼喂养，自由进水、进食，不给予免疫抑制剂。

3 术中及术后操作注意事项

3.1 小鼠的肝脏极为娇嫩，反复翻动可能造成不同程度的机械损伤及微血栓形成，同时激活Kuffer细胞，增加其对缺血/再灌注（I/R）损伤的敏感性，进而加重I/R损伤［16］，因此，分离肝周韧带时动作要轻柔，可以尝试沿顺时针方向进行分离以减少对肝脏的翻动。

3.2 分离供肝IHVC时，可以尝试分离至髂静脉分叉上方水平［17］，这样可以增加IHVC的长度，方便套管。

3.3 供肝灌注时， 应注意灌注压力恰当，一般以30～10 ml/h为宜；灌注压力过高可引起肝细胞损伤，导致肝细胞水肿进而影响供肝质量［18］。灌注时要均匀、缓慢。研究表明，供肝胆道系统的充分灌注可降低胆道并发症的发生率［19］。

3.4 小鼠SHVC管壁薄易碎，吻合难度大， 可使用10-0尼龙缝线“一针法”［20］连续外翻缝合，仅需缝合7或8针，耗时6～8分钟，显著缩短了缝合时间及无肝期，其次，血管内膜外翻有利于保持吻合面平整，防止血栓形成，还可以减少吻合口漏的发生。

3.5 在冷缺血时间里，I/R损伤严重［21］，所以应尽快缩短冷缺血时间。热缺血时间小于20分钟可以提高移植后存活率［22］。PV重建后即开放并同时开放SHVC，可缩短受体无肝期及供肝热缺血时间。

3.6 胆道重建后，用大网膜覆盖胆管支架可以减少胆瘘的发生［14］。

3.7 尽量缩短无肝期，无肝期过长可以加重I/R损伤，造成内毒素样综合征以及严重酸中毒［23］。

3.8 肝动脉系统是供肝侧胆管最主要的血供来源［24］。临床研究证实：肝动脉血栓形成可引起胆道缺血狭窄、胆道坏死、胆瘘、菌血症或脓肿形成等， 是导致移植物肝功能丧失和受体死亡的常见原因［25］。有些学者认为动脉化是小鼠肝移植物存活的必要条件，重建有利于提高受体存活率［26-27］，并且有学者报道了通过支架重建的新方法［28］；也有学者认为， 重建对受体存活率无影响［29］。

3.9 尽量减少手术时间有益于受体术后复苏，据报道，受体和供体平均手术时间最好分别控制在22～23分钟和45分钟左右［30］。

4 总 结

Qian等［4］所报道的小鼠OLT方法1周存活率为83%，近年来国内外学者对该方法不断完善，其1周存活率有所提高。虽然小鼠OLT模型技术难度大，对实验室条件、实验者显微外科技术要求高，但是其对免疫学研究的优越性使得该模型的建立仍然有十分重要的意义。通过不断的实践与总结，相信最终该模型的成活率还会进一步提高。