供肝体外灌注脱脂肪：扩大供体来源新途径

王卫利（译）（天津市第一中心医院移植监护室，天津 300192）

大泡性脂肪肝大于30%可显著增加肝细胞对缺血/再灌注（I/R）损伤的敏感性，是肝移植术后发生移植肝原发性无功能的重要危险因素。随着肥胖、老年人群的增多，脂肪肝的发生率越来越高，从而影响供肝的来源及质量。一些研究表明，在植入前对供肝进行一些代谢干预可降低供肝的脂肪含量。这个设想已经在一些活体肝移植得到了成功验证。但是，尸体供肝需要在体外对植入前肝脏进行处理。一些动物实验已建立了体外对离体肝脏进行常温灌注的模型。据此，我们推测通过体外灌注脱脂肪的过程可能增加供体的来源。本人将就目前关于脂肪肝加剧I/R损伤的机制，以及目前对于该问题的一些解决方案做一综述。

1 供体池脂肪肝的流行病学

脂肪肝是非酒精性脂肪肝病的早中期改变，在北美，在体重指数大于正常范围30%的肥胖人群，脂肪肝的发生率在65%以上［1-2］。形态学上，脂肪肝表现为脂滴在肝细胞内的聚积，根据肝细胞内脂滴大小，可分为小泡性和大泡性脂肪肝。小泡性脂肪肝肝细胞内的脂滴小，散在分布于胞质；一般认为，小泡性脂肪肝供体发生移植肝原发性无功能的风险较小，即使脂肪含量很高也可较安全地使用［3-6］。大泡性脂肪肝则表现为大脂滴位于肝细胞核周围，甚至使细胞核发生移位；目前的研究表明，大泡性脂肪肝是移植术后移植肝原发性无功能的危险因素，并显著增加术后病死率，增加术后肾功能衰竭等并发症［3-6］。近期的一项大型研究表明，脂肪含量大于30%的脂肪肝可降低移植术后1年的生存率［5］，因此，多数移植中心一般放弃脂肪含量大于30%的供肝；但对于小于30%的脂肪肝则一般应用于移植［3-6］。但是当合并存在其他供体危险因素如老年、冷缺血时间长等，大泡性脂肪肝通常也会被放弃使用［5］。在过去的10年，美国肥胖发生率从9.8%上升至27.2%［7］，因此可以预测供体池中大泡性脂肪肝的比例会不断增加。另一方面，人类整体寿命的延长，供体年龄的增加也进一步增加了供体的风险。因此，如果不对大泡性脂肪肝的使用采取相应的处理，我们可能面临不远的将来供体数量的急剧减少。

2 脂肪肝对I/R损伤的敏感性增加

在肝移植过程中，肝脏I/R损伤不可避免，但是研究表明，脂肪肝可显著增加肝脏冷保存及后续的I/R损伤事件。体内及体外的一些动物实验表明，肝脏I/R损伤大部分起始于肝实质细胞内［8-10］，且肝细胞内脂滴大量聚积可加剧肝细胞I/R损伤。有研究发现，小泡性脂肪肝细胞培养相对于非脂肪肝细胞，其对I/R损伤更加敏感，同时，肝细胞损伤后转氨酶的释放水平与肝细胞内的甘油三酯水平成正相关［9］。而在肝细胞内甘油三酯含量接近的小鼠模型，研究发现，大泡性脂肪肝比小泡性脂肪肝对I/R损伤更加敏感，因此表明，除了甘油三酯的含量，大脂滴本身也可加剧I/R损伤［8］。在人体肝脏，脂肪肝增加对I/R损伤的敏感性也已经被广泛报导。

3 脂肪肝增加I/R损伤敏感性的机制

不论是临床观察还是动物实验，目前的研究结果表明，脂肪肝增加I/R损伤的机制包括：① 更多的脂质过氧化反应；② 过度的炎症反应，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子的过度释放，中性粒细胞的大量浸润等［9，11-15］。这些研究并没有区分大泡性还是小泡性脂肪肝。另外，有动物实验发现，脂肪聚积的肝细胞体积增大，使肝窦变窄，影响肝细胞及肝窦微循环；进而影响肝细胞线粒体功能，降低肝细胞内 ATP 水平［8，9，12，15-16］。在Zucker大鼠的在体I/R损伤模型中，研究人员发现，脂肪肝脏的损伤主要表现为坏死，而非脂肪肝脏的损伤则主要表现为凋亡［17］，可能的解释是，脂肪肝细胞内的ATP水平低下，而凋亡是一种需要ATP的细胞死亡。研究还发现，抑制凋亡可减轻非脂肪肝脏的I/R损伤，而对脂肪肝脏则没有这种作用，进一步表明了脂肪肝相对于非脂肪肝在肝细胞损伤死亡机制上的不同［17］。

4 减轻脂肪肝I/R损伤的可能途径

在动物实验模型，一些不同的方法、技术被不断尝试用于减轻脂肪肝的I/R损伤，包括药物预处理、缺血预处理的方法或是联合药物和缺血预处理。

4.1 药物预处理

尽管有很多药物被用来研究减轻肝移植过程的I/R损伤，但只有很少一部分是关于脂肪肝的研究［6］。一些研究将这些药物加入冷保存液中，发现可以减轻脂肪肝大鼠的I/R损伤相关指标。如α受体、β受体阻断剂卡维地洛可降低再灌注后转氨酶水平、血管阻力、活性氧自由基水平，同时增加胆汁分泌量，增加肝内ATP水平［12］。另一项在肥胖Zucker大鼠I/R模型的研究发现，在再灌注前静脉注射抗氧化剂谷胱甘肽酯可显著降低脂质过氧化、I/R损伤标志物及肝细胞死亡水平［11］。在另一个类似的动物实验，研究人员发现，在再灌注开始前24小时持续静脉输注他克莫司显著降低了肝脏损伤水平，同时通过增加肝细胞内ATP水平使术后15天的生存率由40%升高到了70%。另一项研究在低温I/R损伤的CMDD大鼠模型，该实验通过给予无胆碱及无甲硫氨酸饮食诱导大鼠混合性脂肪肝，在肝脏的谷胱甘肽水平恢复正常前15分钟给予谷胱甘肽前体N-乙酰半胱氨酸，可降低肝脏死亡标志物水平，减轻微循环损伤［15］；同时，该研究还发现，在热缺血开始前60分钟给予细胞黏附分子-1（ICAM-1）的抗体可抑制中性粒细胞浸润，降低肝细胞死亡标志物水平［15］。总之，尽管上述研究结果均显示了药物预处理可显著减轻肝细胞死亡标志物水平，但在多数的研究中，脂肪肝的损伤水平仍然高于非脂肪肝脏［11-12，18］。值得注意的是，上述研究中均为单种药物预处理，或许联合多种药物进行预处理可显著减低脂肪肝对I/R损伤的敏感性。

4.2 缺血预处理

缺血预处理是通过在缺血发生前给予短暂的缺血处理，目前的研究表明，不论是大泡性还是小泡性脂肪肝，缺血预处理可减轻再灌注后的脂质过氧化，改善肝脏微循环，减少中性粒细胞浸润［8］。但是，缺血预处理对脂肪肝的保护作明显低于其对非脂肪肝的保护作用，缺血预处理能使小泡性脂肪肝的肝细胞死亡标志物水平降低到非脂肪肝水平，但大泡性脂肪肝的肝细胞死亡标志物水平始终高于基线水平［8］。缺血预处理的保护作用机制可能与一氧化氮（NO）有关［8，11］。在患者行半肝切除手术时，缺血预处理也显示了其对后续的I/R的保护作用。对轻中度脂肪肝亚组患者进行进一步分析，缺血预处理能降低肝脏损伤标志物的水平（血清丙氨酸转氨酶 /天冬氨酸转氨酶）［19］。

4.3 热休克预处理

热休克预处理也是一种可减轻I/R损伤的实验方法。研究发现，在混合性脂肪肝的肥胖Zucker大鼠的I/R损伤模型，热休克预处理可改善肝脏微循环参数，包括肝窦灌注率、肝窦直径和白细胞内皮黏附［20］，防止微循环衰竭；该实验还发现，热休克预处理能降低氧化应激水平，减少肝脏损伤标志物水平［20］。类似的，在混合性脂肪肝的CMDD大鼠，热休克预处理显著提高了肝移植术后1周的生存率［21］；而且，研究发现，该热休克保护作用的时间窗（热休克处理后的6～24小时）正好与肝脏内的热休克蛋白（HSP）表达相关，尤其是HSP72 及血红素氧化酶 -1（HO-1）［20-21］。热休克预处理的保护机制尚未阐明，关于热休克预处理的具体实施方案，尤其是实施方案的合理性及可操作性，有待进一步研究。

5 体外脱脂肪：脂肪肝预处理的另一新选择

上述预处理途径主要通过降低大泡性脂肪肝I/R损伤相关事件，但是对于大泡性脂肪肝，严重的I/R损伤仍然不可避免，因此，通过在再灌注损伤发生前对脂肪肝进行脱脂肪处理可能是一种更加直接有效的方法。而且这种方法已经在人活体肝移植中得到了验证，脂肪肝供体经过2～8周的控制饮食、联合运动及药物可使大泡性脂肪含量降低3倍［22-23］。该研究中，3位活体肝移植供者均通过活检证实大泡性脂肪肝大于30%，他们通过1个月ω-3脂肪酸治疗显著降低了大泡性脂肪的含量［22-23］。上述研究中，同过“脱脂肪”均降低了大泡性脂肪含量并成功进行了肝脏移植［22-23］。应该指出，节食、运动可广泛影响供体的代谢状态，除了减轻脂肪肝，可能还存在其他非直接的因素影响供肝的质量。

动物实验中常常通过饮食调整来调节肝脏的脂肪含量；在肝细胞培养的研究中，通过调整培养液的成分也可降低肝细胞的脂肪含量，这些“脱脂肪”的肝细胞对I/R损伤的敏感性也可恢复正常［9，24］。在CMDD诱导的大泡性脂肪肝大鼠实验模型，在肝移植前对供体进行饮食控制至少3天来降低肝细胞内甘油三酯含量，可使肝移植受体的存活率从0%提高到75%［9］。另一项研究，对ob/ob小鼠给予48小时脂肪酸合成酶抑制剂治疗，可使大泡性脂滴转变为小泡性脂滴，进而提高了I/R损伤后的生存率［24］；而且在肝脏获取及移植前分别给予2天、4天或7天的脂肪酸合成酶抑制剂治疗，移植后受体的存活率也随治疗时间的增加而相应地提高［24］。值得注意的是，脂肪酸合成酶抑制剂治疗可增加肝脏ATP水平，并对内源性线粒体非偶联蛋白2有降调节作用［24］。总之，上述研究表明，通过“脱脂肪”，可逆转大泡性脂肪肝对I/R损伤的敏感性。

6 体外机械灌注“脱脂肪”

上述研究都是有关活体肝移植，通过对脂肪肝供体进行若干天的治疗干预，其“脱脂肪”策略是有效的；但是在尸体肝移植，“脱脂肪”的时间必须加速至若干小时，这样才能与目前肝脏获取至移植的时间窗相吻合，一般在12小时以内［25-26］。尽管在器官获取前对尸体供体进行“脱脂肪”治疗在理论上也可行，但是通过对获取的供肝进行机械灌注，对于灌注的药物种类及剂量将会更加灵活［27］。目前，有研究通过对Zucker大鼠脂肪肝进行几小时的体外灌注来“脱脂肪”，研究结果令人鼓舞［28］。

机械灌注不但能给予“脱脂肪”制剂提供一个很好的输注平台，相对于传统静态的冷保存，其本身就能改善肝脏的活力，这些已经在包括非脂肪肝、缺血肝脏及大泡性脂肪肝的机械灌注研究中得到了证实［13，27，29］。研究发现，对从 CMDD 大鼠获取的大泡性脂肪肝进行1小时的体外常温灌注，相对于静态的冷保存，其肝脏死亡标志物水平下降，胆汁分泌量、氨清除率、尿素产生及ATP水平则显著增加［30］。目前尚未对人的肝脏常温机械灌注进行研究，但在哥伦比亚大学近期完成的一项1期临床试验结果发现，相对于静态冷保存，体外低温机械灌注7小时可减少术后早期移植物功能障碍、胆道并发症、血管并发症的发生，缩短住院时间［25］。后续的研究显示机械灌注可降低前炎症因子水平，增加受体肝脏ATP水平［26］。但是，目前尚无针对人类大泡性脂肪肝进行机械灌注的研究。

目前已有3项关于大泡性脂肪肝体外机械灌注“脱脂肪”的动物实验研究［13，28，31］。Jamieson 等［31］对猪肝进行体外48小时的常温机械灌注，发现肝脏内的脂滴含量降低了50%，接近非脂肪肝的对照组水平。通过60小时的体外脱脂肪，脂肪肝组的一些肝功能指标如胆汁分泌量，尿素生成量及白蛋白水平与非脂肪肝脏对照组相仿［31］。另一项研究中，采用类似的体外灌注技术对肥胖Zucker大鼠肝脏进行6小时不同温度（4、8、20 ℃）的体外机械灌注，研究结果显示，相对于冷保存，机械灌注显著降低了肝细胞死亡标志物水平，改善了肝脏功能［13］；而且20 ℃的机械灌注相对于4 ℃和8 ℃更好的保存了肝脏功能［13］；组织学研究也发现，20 ℃的体外灌注可降低脂肪肝细胞的脂滴含量，而4 ℃和8 ℃的机械灌注则无上述“脱脂肪”效果［13］。

另一动物实验研究旨在探讨加速体外灌注过程［28］，希望能把体外灌注的时间与目前临床肝脏保存时间相一致。该研究首先通过对肝细胞培养液加入不同的药物，筛选出潜在的脱脂肪药物，然后将筛选出的药物混合配置成“鸡尾酒”，再对Zucker肥胖大鼠肝脏给予“鸡尾酒”体外常温灌注，灌注3小时，肝细胞内的甘油三酯含量降低50%，大泡性脂滴减少，并转为小泡性脂滴。这种脱脂肪速度显著快于肝细胞培养液的脱脂肪速度，一般在肝细胞培养液中，该过程需要几天的时间。这种脱脂肪速度的显著不同，可能的解释是肝细胞培养液不含肝细胞以外的间质细胞，但是目前对于间质细胞在脱脂肪中的作用尚不明确［9，10］；另一可能的解释是相对于静态的细胞培养，器官灌注能提供肝细胞足够的营养及其他因子，同时有效清除代谢废物的排出，进而加快脱脂肪速度［28］。

7 加强脱脂肪的策略

7.1 常温体外灌注

尽管体外常温灌注在动物实验研究中取得了成功，但将其用于临床脂肪肝体外脱脂肪仍需要克服若干障碍。尽管机械灌注的概念已被临床接受，但目前所有的灌注系统均为低温灌注，并不是常温灌注［25，32］。因为脂质氧化及转运的过程可能在低温状态下会显著减慢，低温状态可能不利于脱脂肪，尽管该问题尚未得到实验证实［29，33］。另一方面，超生理状态的灌注温度可能也是一个研究课题，因为高温有可能触发热休克预处理，进而保护器官的I/R损伤［21］。然而，一旦有足够多的证据支持体外低温灌注临床应用的可行性，临床研究人员可能会倾向于向体外常温灌注研究领域迈进。

常温体外灌注系统要求进一步研制可转运的灌注设备，以适应临床上陆地及航空转运的需要。同时，常温灌注系统需要更高的阈值，因为一旦出现机器故障，无论是识别异常还是工作异常，血流停止会引起快速的热缺血损伤；相反，在低温灌注系统，一旦出现上述问题，血流停止也仅仅是相当于目前临床常规应用的冷保存，其对器官的损伤远小于热缺血损伤［25-27］。

但是，常温灌注带来的益处可能远远大于上述顾虑可能产生的不利。常温灌注状态下，肝脏处于代谢活性状态，这样有利于对肝脏功能的全面评估，进而利于肝脏移植，这是单纯的冷保存或低温机械灌注所不能比拟的。体外常温机械灌注这种创新的复苏干预所带来的益处可能会使研究人员不断发展完善这种技术，并向临床应用推进［27］。

7.2 优化灌注液

肝脏脱脂肪的最终目标是快速降低含大泡性脂滴的肝细胞比例，进而维持肝脏的高活性和高功能。脂肪肝的发生是肝细胞甘油三酯合成及分解过程不平衡的结果［1，2，9，28］。所以，脱脂肪的过程应该使这种不平衡向着增加甘油三酯分解及相关代谢产物排出，减少甘油三酯合成的的方向转移［9，28，31，34］。虽然脂肪代谢的过程已经十分明确，但是应用药物来调节脂质代谢过程以获得快速脱脂肪，而不影响肝脏活力及功能，仍有大量的工作要做。

已有大量的文献报道关于肝脏脂质代谢的转录因子，但是转录调节一般需要的反应时间至少6小时，因此针对转录途径的复合物并不能在体外灌注的时间窗内起作用。通过转录后途径作用的药物，包括信号效应分子，代谢底物及共作用因子，可考虑用于体外灌注。下面简要介绍脂肪合成、分解的过程。脂肪分解需要Perilipins与脂肪酶作用，Perilipins是位于甘油三酯脂滴表面的蛋白，脂肪酶则分解甘油三酯为二酰甘油、单酰甘油、游离脂肪酸及甘油［28，34-36］。Forskolin可间接激活蛋白激酶A（PKA），增加脂滴表面的Perilipin5的磷酸化，加速脂肪分解过程［28，36，37］。脂肪分解产物如不及时代谢和（或）被分泌至肝细胞外，可重新合成脂肪。脂肪分解产物可通过酯化反应重新合成甘油三酯，与VLDL结合成脂蛋白颗粒进而分泌到肝细胞外［34］。脂蛋白B及磷脂是极低密度脂蛋白（VLDL）的重要组成成分，添加氨基酸及胆碱被证实能分别促进脂蛋白B及磷脂的合成，进而降低脂肪合成［28，38］。另一加速脱脂肪的途径是增加游离脂肪酸向线粒体转运，加快脂肪酸的β氧化［28，39］。游离脂肪酸从胞质向线粒体转运是β氧化的限速步骤，该步骤需要位于线粒体外膜的肉碱软脂酰转移酶（CPT-1）将乙酰辅酶A与L-肉碱结合并转运。体内、体外的研究均显示，膳食补充L-肉碱或向细胞培养基中加入L-肉碱可加速脂肪酸的β氧化，降低肝脏甘油三酯含量［40］。因此，通过同时多个途径联合作用可能产生更有效的脱脂肪效应，但是这种联合脱脂肪方案的合理设计需要对大泡性脂肪肝细胞相关代谢途径之间的潜在相互作用有更加深入的理解。建立适宜的大泡性脂滴肝细胞培养系统将十分利于上述问题的研究，但是目前文献仅有一些小泡性脂滴肝细胞培养系统的描述，尚未见有大泡性脂滴肝细胞培养报道［9，28］。

最终，外科医师需要大量的证据来证实，通过脱脂肪的肝脏确实与正常的非脂肪肝脏十分相似，体外脱脂肪才能在临床被真正广泛认可。因此对脂肪肝通过体外短时间的常温机械灌注进行快速脱脂肪后的短期和长期功能评估将是至关重要的。虽然目前仍有大量的问题需要解决，但肝脏体外脱脂肪仍被认为具有巨大的应用前景，将可能使目前大量被丢弃的脂肪肝应用于肝脏移植。