感染乙型肝炎病毒动物模型的建立与应用

张博雅，沈中阳，宋红丽（.天津医科大学第一中心临床学院，天津 3009；.天津市第一中心医院器官移植中心，天津 3009；）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是引起急慢性肝炎、肝硬化、原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的重要诱因之一［1］。肝细胞内持续HBV感染以核内共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的持续存在为特征，HBV cccDNA是病毒转录和复制的原始模板，并能长期稳定存在于被感染肝细胞的核中，其长期存在与乙型肝炎慢性化有重要关系［2-3］。建立合适的HBV感染的动物模型很困难，这也制约着HBV导致的人类病毒性肝炎的发病机制、预后及HBV清除等方面的研究。目前，HBV相关性终末期肝病是我国肝移植的主要适应证。若肝移植术后不采用任何有效的预防措施，HBV再感染率较高［4］。建立合适、稳定的HBV动物模型，有利于促进对肝移植后乙型肝炎的复发机制、抑制HBV再感染药物及扩大肝移植供肝范围等研究。随着细胞培养、基因工程及其他相关技术的发展，有关HBV感染的细胞模型及动物模型均已相继建立。本文就HBV动物模型其建立方法及应用进行综述。

1 HBV感染的大动物模型

于1985年有研究人员开始进行HBV类病毒在家养动物的感染情况的研究［5］，使用人诊断试剂盒检测HBV，结果显示大多家养动物的HBV血清标志物为阳性［6-7］。

1.1 HBV感染猪动物模型

Li等［8］提供一个肝脏慢性嗜肝病毒感染有关的模型，研究的目的是找到嗜肝病毒家族在猪流行存在的证据。筛选结果表明，总患病率为24.8%，结果意味着猪乙型肝炎病毒（swine hepatitis B virus，SHBV）可能是猪的病原体。SHBV的发现为嗜肝病毒进一步的研究提供了新的信息。然而到目前为止，这些类病毒没有被确定，只有在中国发现相关的报告。

1.2 HBV感染灵长类动物模型

人乙型肝炎病毒（human hepatitis B virus，HHBV）宿主范围非常狭窄，具有嗜肝性，所以建立合适的HBV感染的动物模型很困难。非人类的灵长类动物（黑猩猩、长臂猿等）可以感染HBV，且感染的HBV基因类型与感染人类的基本一样［9］。

在1972年，London等［10］报道，HBV可以传播给恒河猴，但随后发现该研究结果无法证实。2002年，Gheit等［11］报道，巴巴里猿可能在肝内转染克隆人类HBV后发生急性感染，可检测到HBV DNA和HBsAg。HBV在长臂猿种群中的病毒感染率可达23%～33%，在猩猩中的病毒感染率可达15%［12］。HBV感染动物模型中最有效的HBV仍是黑猩猩，但由于黑猩猩来源困难，并受动物伦理限制，模型难以推广［13-14］。食蟹猴中自然、持续HBV感染的发现，首次为免疫学与人类相似的慢性HBV感染新的小型猿模型提供了证据［15］，这将对慢性乙型肝炎免疫治疗方法的研究具有重要价值。

2 HBV感染的小动物模型及应用

2.1 鸭乙肝病毒（duck hepatitis B virus，DHBV）感染鸭乙肝模型及应用

DHBV感染的鸭乙肝模型提供了一个研究体内抗HBV药物活性和毒性的合适体系。赵克开等［16］选择持续感染DHBV的2月龄上海麻鸭进行四氯化碳（CCl4）灌胃，然后处死动物取肝组织评价肝损伤程度。最终发现，在肝组织发生严重损伤时，血清中可以出现DHBV cccDNA，血清中DHBV cccDNA的检出与肝组织损伤程度显著相关。鸭乙肝模型在评估核苷类似物在体内抗病毒效果中被证明是有用的。在DHBV感染的雏鸭体内，短期使用病毒DNA聚合酶抑制剂可诱导病毒血症的一过性降低，但不能清除肝内的cccDNA，在治疗停止后病毒复制会有明显的反弹［17］。DHBV感染鸭乙肝模型是细胞表面病毒受体、病毒清除机制以及筛选新的抗病毒药物的合适动物模型［18］。但由于DHBV只感染鸭而不能感染人，所以此模型仍不能很好地再现人的HBV感染过程。

2.2 HBV感染树鼩模型及应用

多项研究表明，树鼩肝脏对人类HBV有着易感性［19］。从20世纪80年代起，国内外即有报到证实树鼩接种HBV后可在肝脏中检测到HBV感染和复制情况。树鼩的血清和肝细胞有人HBV标志物，利用血清学、免疫组织化学、分子杂交以及电镜检查等技术，在接种了人HBV的树鼩血中可查见HBsAg及Dane颗粒，在肝细胞也检测出HBsAg、HBcAg及HBV DNA，表明树鼩可感染人HBV形成动物模型且感染率较高，但是感染为一过性，不能使其形成长期的HBV携带者［20］。

Ruan等［21］建立了长期感染HBV的树鼩模型，定期收集血清和肝脏组织样本，显示出肿胀的脂肪变性和嗜酸性变性，并有淋巴细胞浸润和增生，小胆管口观察显示多个坏死区域融合形成桥接坏死、纤维化以及巨红细胞症。肝组织病理学变化观察到长期感染HBV的树鼩与HBV感染的人类相似，可以用树鼩代表新型HBV感染的动物模型。周勇等［22］经大隐静脉，用萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，Fluc）和 β- 半乳糖苷酶（β- galactosidase，β-Ga1）作为报告基因，通过树鼩大隐静脉将报告基因用水动力注射方法导入树鼩肝脏，通过活体成像和β-Gal染色来观察水动力转染效果。将pHBV1.2质粒用水动力注射方法转入树鼩肝脏，确定了水动力转染树鼩肝脏的条件，注射容量越大，速度越快，肝脏转染效率越高，同时造成的肝脏损伤越大，外源基因表达效率也越高。曾扬等［23］通过大腿内侧静脉注射将携带有1.3HBV的重组8型腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus 8，rAAV8-1.3HBV）导入树鼩肝脏，荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测树鼩肝脏和血清中HBV DNA，55天时肝组织HBV DNA拷贝数仍可达到104～105IU/ml。说明重组8型腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus 8，rAAV8）所携带的HBV基因组高效专一导入树鼩肝细胞并复制表达，也成功建立HBV急性感染树鼩模型。2009年，杨芳等［24］用新生树鼩感染人HBV，结论为新生树鼩能够长期感染HBV，并且HBV能够在树鼩体内稳定复制和长期存在。

2.3 HBV感染小鼠模型

小鼠作为实验室最常使用的动物，易于饲养，遗传背景清楚，全序基因组已完全确定，这决定了小鼠是最理想的动物模型。虽然普通小鼠无法直接感染HBV，但是通过多种分子生物学手段，可以建立适合于各种研究目的HBV小鼠模型，这为HBV的研究提供了非常有用的工具。

2.3.1 HBV人-鼠嵌合肝模型

将人肝细胞移植到鼠的肝脏构建“人鼠嵌合肝”模型可以模拟HBV复制的全过程，不但解决肝炎病毒感染的种属特异性问题，而且可用于抗HBV治疗和细胞受体的研究及了解肝脏再生和细胞分化［25］。HBV-Trimera小鼠是第一个能支持HBV复制的人鼠嵌合模型。Ilan等［26］给正常小鼠致死剂量射线全身照射以消除小鼠的免疫活性，再把重症联合免疫缺陷（SClD）鼠的骨髓细胞立即静脉注射移植给该小鼠，使后者的骨髓细胞及红细胞系得以再生，最后将离体感染HBV的人肝组织移植到该小鼠肾被膜下或耳廓部，构建成HBV三合体小鼠模型。研究发现，在移植1个月后，三合体小鼠体内存活的人肝细胞可重现HBV自然感染人体时的复制过程。约有80%的小鼠可以检测到病毒血症，但是小鼠血清中的病毒滴度仅为105拷贝/ml血液，且持续时间也只有20天，可用于短期研究药物抗病毒活性分析。

uPA/SCID小鼠模型是目前最好的HBV感染复制模型，该模型小鼠因为被转入具有肝脏毒性的uPA 基 因（urokinase plasminogen activator， uPA），自身的肝细胞生长受到抑制，而植入的肝细胞具有生长优势，加之该小鼠无免疫排斥能力，适合于移植肝细胞的生长［27］。将原代人肝细胞移植入Alb-uPA转基因鼠和严重联合免疫缺陷小鼠（Cb-17/SCID/bg）杂交而成的uPA/SCID小鼠建立嵌合肝后，发现人的肝细胞可以占到整个肝脏的绝大部分，该肝脏近乎完全人源化。然后通过将HBV DNA阳性人的血清接种到该鼠，可以检测到达1010拷贝/ml的高水平的病毒血症，而且持续达5 个月之久［28-29］。

由于uPA/SCID小鼠没有免疫功能，对于研究HBV的致病机制以及HBV与宿主免疫系统的相互关系仍然是一个难以克服的问题，一种间接的解决方法就是使用人抗HBV免疫细胞对小鼠进行处理，失去uPA基因的小鼠肝脏重新获得生长优势，结果会导致小鼠肝细胞比例增加，实验发现人肝细胞所占总肝细胞的比例直接影响了血清HBV的含量。uPA/SCID小鼠的饲养和繁殖也是一个问题，由于没有细胞免疫和体液免疫，加上肝脏不能正常发育，因此出生死亡率很高［30］。

2.3.2 HBV转基因小鼠模型

HBV感染具有严格的种属特异性，但其复制并无种属特异性，因而可以通过转基因方法将人HBV基因转入小鼠胚胎干细胞，使HBV基因进入小鼠体内并在肝脏和肾脏中复制和分泌HBV病毒。除HBV全基因组转基因小鼠外，还有HBV部分片段转基因小鼠模型。Madden等［31］和Zhu等［32］报道HBx转基因小鼠可导致HCC，但HBx并不单独致癌，而是与其他致癌基因和环境致癌物共同致癌，其致癌机制与抑癌基因p53相关。在转大S基因小鼠中发现，大S基因表达导致大量S蛋白堆积于肝细胞内，产生肝细胞毒性及代偿性增生，直至引发肝癌。另有实验证实，全长的preS/S基因产物不具有反式激活作用，而presl、pres2区突变的preS/S基因的表达产物诱导DNA的氧化损伤，可能与HBV相关性HCC的发生有关［33］。

2.3.2.1 高压水动力注射法造HBV小鼠模型

水动力注射法是Zhang等［34］提出的，通过尾静脉注射裸DNA小鼠使外源基因在肝内表达的一种技术方法。Huang等［35］采用水动力法注射HBV质粒后在C57BL/6小鼠中建立HBV慢性感染模型，将1.2个拷贝HBV基因组克隆至重组的腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体中，C57BL/6小鼠注射。结果约40%注射鼠HBV表面抗原表达长达6个月，而HBV的转录、复制中间体及蛋白的表达在1年之内都存在，说明小鼠HBV持续感染模型的构建是成功的。

尽管利用C57BL/6小鼠并采用水动力法制备HBV小鼠模型获得成功，但是许多相关研究还存在HBV病毒在体内短时间存在的问题。郭燕菊等［36］构建了含腺相关病毒倒转末端重复序列元件与包含1.3个拷贝HBV基因组（ayw 亚型）的HBV表达质粒（pAAV-HBV1.3），并将pAAV-HBV1.3质粒经高压水动力法尾静脉注射C57BL/6小鼠，正常免疫状态下，检测血清及肝组织的HBV抗原及病毒载量均为阳性，且与对照组差异显著（P＜0.01，P＜0.05）。最后采用腹腔注射免疫抑制剂地塞米松注射液（dexamethasone， DEX），使小鼠处于免疫抑制状态下，可用高压水动力法建立了乙肝病毒转染小鼠模型，在60天仍可检测到HBsAg、HBeAg的表达。以上结果表明，通过高压水动力法建立的急性乙肝小鼠模型，通过抑制小鼠免疫状态，可延长病毒在小鼠体内存留时间。

2.3.2.2 重组腺病毒转导的HBV小鼠模型

HBV转基因小鼠是目前较为常用的携带HBV基因组的小鼠模型，但转基因小鼠的HBV整合在宿主染色体中，不形成cccDNA，而cccDNA是前基因组及各种长度的病毒RNA的转录模板，在HBV复制周期中起着重要作用［37］。腺病毒载体是一种非常有效的转基因载体，具有高效率、高滴度、低致病性及不整合宿主细胞染色体等优点，广泛应用于基因治疗及疫苗的研究。HBV具有严格的种属特异性，只感染人及少数灵长类动物，而腺病毒载体可感染分裂期和静止期的细胞，可以转导包括肝细胞在内的多种细胞，因而可以将HBV基因导入到肝细胞及小鼠体内［38］。

基于AAV8病毒的肝脏高亲嗜性，董小岩等［39］用高嗜肝性的重组8型腺相关病毒（Recombinant adeno-associated virus type 8，rAAV8）载体携带1.3个拷贝HBV基因组（ayw 亚型）体内转导法，建立持续表达HBV抗原的C57BL/6 小鼠模型。检测HBV DNA拷贝数显示，小鼠血清中HBV DNA的水平＞103拷贝/ml，肝脏中＞2.5×106拷贝/g，在小鼠肝组织中可检测到环化HBV DNA，提示AAV8 载体携带的线性HBV DNA可成功恢复成HBV的环化形式。结果表明，本研究成功地建立了HBV在肝内稳定复制并持续表达HBV抗原的小鼠模型，为进一步研究HBV慢性持续感染的机制与应用于药物开发以及疫苗评价打下了基础。随后王国婧等［40］探索用重组rAAV8载体携带1.3个拷贝乙型肝炎病毒（rAAV8-1.3HBV）介导的HBV持续感染小鼠模型以评价核苷酸类似物抗病毒药物恩替卡韦（entecavir，ETV）及拉米夫定（lamivudine，LAM）的抗病毒效果。结果表明，ETV和LAM能有效抑制模型小鼠中HBV病毒的复制，而对HBeAg和HBsAg表达水平无明显影响；提示AAV8-1.3HBV介导的HBV持续感染小鼠模型制备简单，成模率高，可有效体现出ETV和LAM的抗HBV作用效果，从而用于核苷酸类似物抗HBV药物的筛查。

3 结 语

HBV宿主范围狭窄且具有嗜肝性，所以建立合适的HBV感染的动物模型很困难。研究人员在猪体内仅找到SHBV，认为可能是猪的病原体，然而到目前为止，这些种类病毒没有被确定，只有在中国发现过相关的报告。非人类的灵长类动物（黑猩猩、长臂猿等）感染的HBV基因类型与感染人类的基本一样，最有效的感染动物模型是黑猩猩，但由于黑猩猩来源困难，并受动物伦理限制，模型难以推广。食蟹猴自然、持续感染HBV的模型的发现，首次为免疫学与人类相似的慢性HBV感染的新的小型猿模型提供了证据。

DHBV感染的鸭乙肝模型提供了一个研究体内抗HBV药物活性和毒性的合适体系，但由于DHBV只感染鸭而不能感染人，所以此模型仍不能很好地再现人的HBV感染过程。研究表示，树鼩肝脏对人类HBV有着易感性，研究人员成功建立了HBV急性感染树鼩模型，但感染仅为一过性。用新生树鼩感染人HBV表明，新生树鼩能够长期感染HBV，并且HBV能够在树鼩体内稳定复制和长期存在。

虽然普通小鼠无法直接感染HBV，但是通过多种多样的分子生物学的手段，却可以建立适合于各种研究的HBV小鼠模型，如HBV人-鼠嵌合肝模型和HBV转基因小鼠模型。HBV人-鼠嵌合肝模型可以模拟HBV复制的全过程，但嵌合小鼠没有免疫功能，对于研究HBV的致病机制以及HBV与宿主免疫系统的相互关系仍然是一个难以克服的问题。HBV的复制并没有种属特异性，因而可以通过转基因的方法将人HBV基因转入小鼠胚胎干细胞，使HBV基因进入小鼠体内并在肝脏和肾脏中复制和分泌HBV病毒。腺病毒载体可以转导包括肝细胞在内的多种细胞，因而可将HBV基因导入到肝细胞及小鼠体内。目前已成功地建立了HBV病毒在肝内稳定复制并持续表达HBV抗原的小鼠模型，为进一步研究HBV慢性持续感染的机制与应用于药物以及疫苗评价打下了基础。