研究生分子生物学综合实验设计——IMPACT蛋白单柱亲和纯化

赵仲麟，李 燕，朱 伟，张淑利，贾树恒，马斌强，袁 超*

(1.河南农业大学理学院，河南 郑州450002;2.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南 郑州450002; 3.河南农业大学农学院，河南 郑州450002)

0 前言

生物类专业研究生实验课程培养中，分子生物学是一门重要的学位课。分子生物学通过研究生物大分子的结构和功能等方面的内容来阐明各种生命现象的本质，其技术手段越来越多的应用到农业、医学、环保、制药等的众多领域中。研究生培养关键是要提高学生的实践能力和创新能力，而实验课是研究生能力培养中的重要一环。培养学生的创新能力、动手能力，就需要充分发挥学科的优势，把最新的科研成果和实验技术融入到研究生实验教学环节中。

本文设计了一个针对研究生分子生物学课程的综合实验，利用IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding)系统对蛋白进行表达纯化，以大肠杆菌作为宿主菌。本实验将分子生物学和基因工程所学部分内容相整合，既巩固了学生的理论知识又科提高学生的实验操作技能。该方法为新型蛋白纯化方法，国内使用较少，增加了学生的学习兴趣的同时，更利于让学生了解最新的实验技术手段。对于提高学生的创新和研究能力、培养科研创新思维具有重要意义。

1 实验原理

IMPACT系统是一种新型的蛋白融合表达及纯化系统，已应用到蛋白质工程的许多重要领域［1～5］。IMPACT表达的目的蛋白与内含肽(intein)及几丁质结合蛋白(CBD)形成融合蛋白，通过几丁质柱亲和纯化融合蛋白。然后诱导内含肽的肽键裂解活性，在几丁质介质上将目标蛋白释放出来，而内含肽与几丁质结合蛋白仍结合在几丁质介质上，达到单柱分离纯化蛋白的目的。

将目的蛋白连接到pTWIN2载体Intein 2的N端，DTT还原剂可诱导内含肽N端肽键裂解，将目标蛋白释放出来(图1)。此外，还可以将目的蛋白连接到pTWIN2载体Intein 1的C端，通过温度和pH的改变即可诱导内含肽C端肽键裂解。但C端融合的反应条件是室温过夜，高温可能使目的蛋白变性，因此，对于热不稳定的蛋白则最好选择Intein 2的N端融合。

2 试剂

高保真HiFi Taq酶(全式金公司)，dNTPs，IPTG，氨苄青霉素，氯化钙，T4 DNA连接酶(NEB)，限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ(TaKa-Ra)，琼脂糖，Goldview核酸染料，PCR纯化试剂盒(上海生工)，10 mM EDTA(pH 8.0)，1.0% SDS，0.2 M NaOH，冰醋酸，5 M乙酸钾，25 mM Tris-HCl(pH 8.0)，50 mM葡萄糖，氯仿，无水乙醇，DTT等均为国产分析纯。

图1 IMPACT蛋白纯化原理

3 仪器

离心机、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、超净工作台、培养箱、水浴锅、移液器等。

4 实验步骤

4.1 基因的PCR扩增

选取含有目的蛋白基因的载体为模板，根据其基因序列设计正向及反向引物，进行PCR扩增反应。正向引物前端加入NdeⅠ酶切位点，反向引物引入XhoⅠ酶切位点，也可根据具体情况使用其它限制性内切酶，参见(https://www.neb.com/products/n6952-ptwin2-vector)。PCR反应体系如下(总体积为20 μL):模板DNA 0.4 μL(200～300 ng)，正向引物和反向引物各0.4 μL(20 μM)，dNTPs 2 μL(2.0 mM)，10×Buffer 2 μL，高保真Taq酶0.2 μL(2.5 U)，去离子水14.6 μL。反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃补充延伸10 min。延伸时间可根据基因片段长度和聚合酶延伸速度进行调整。将反应后的体系进行琼脂糖电泳，之后纯化回收产物，备用。同时送部分纯化产物交测序公司进行测序验证，确保无碱基突变。

4.2 表达载体的构建

本实验建议使用pTWIN2质粒(NEB公司)或其他内含肽系列的载体作为表达载体。将pTWIN2质粒和目的基因PCR产物分别使用NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切消化。通过电泳或PCR纯化试剂盒进行片段回收。将载体与PCR产物按1∶3比例混合，加入T4 DNA连接酶0.5 μL，10×Ligation Buffer 1 μL，连接体系共10 μL，混匀之后4℃连接过夜。使用氯化钙转化法将连接产物42℃热击90 s后转化感受态大肠杆菌E.coli ER2566，涂布于含氨苄青霉素(50 μg/mL)的LB平板上筛选转化子。感受态大肠杆菌E.coli ER2566的制备及具体转化步骤参见分子克隆实验指南第三版［6］，也可使用E.coli BL21作为感受态细胞。

4.3 重组质粒的鉴定

在氨苄青霉素LB平板上挑取数个转化子，分别接种到5 mL LB液体培养基中(氨苄青霉素50 μg/mL)，37℃培养过夜。取菌液2.0 mL放入2.0 mL的离心管中，12 000 rpm离心2 min，弃上清，所得菌体使用碱裂解法提取质粒，最后干燥后质粒使用40 μL无菌水溶解。每管各取0.5 μL质粒进行PCR验证，反应体系如下(总体积为20 μL):质粒DNA 0.4 μL，正向引物和反向引物各0.4 μL(20 μM)，dNTPs 2 μL(2.0 mM)，10× Buffer 2 μL，普通Taq酶0.2 μL(2.5 U)，去离子水14.6 μL，反应条件同4.1中条件。将反应后产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如有目的条带，则表明载体构建成功。

4.4 目的蛋白的诱导表达

将鉴定好的含有正确重组质粒的转化子，挑取单菌落，接种到10 mL LB液体培养基中(含氨苄青霉素50 μg/mL)，37℃培养过夜。之后按照1%接种量转接至10 mL的LB液体培养基(含氨苄青霉素100 μg/mL)。37℃振荡培养至OD600达0.6，加入终浓度为0.2 mM的IPTG，30℃诱导5 h诱导蛋白表达。6 000×g离心5 min收集菌体，使用缓冲液1(20 mM Tris-HCl，pH8.5，0.5 M NaCl，1 mM EDTA)将菌体重悬，冰浴，超声破碎细胞，使蛋白释放。12 000 rpm离心30 min，上清即为澄清的细胞粗提物。取样5 μL进行SDSPAGE电泳鉴定，大肠杆菌粗提液通过12% ～15%的SDS-PAGE进行电泳检测，过程中需加入蛋白分子量标准，电泳后通过考马斯亮蓝染色。

4.5 蛋白亲和纯化过程

使用10倍柱体积的缓冲液1(20 mM Tris-HCl，pH8.5，0.5 M NaCl，1 mM EDTA)对几丁质树脂进行平衡。将离心后的细胞粗提物缓慢加入几丁质柱，流速约为0.5 mL/min。取少量穿透液进行SDS-PAGE电泳，与细胞粗提物的电泳进行比较，观察亲和柱的蛋白结合效率。过柱后，用至少10倍柱床体积的缓冲液2(20 mM Tris-HCl，pH 7.0，1 mM EDTA，500 mM NaCl，40 mM DTT)彻底洗柱，由于CBD和几丁质树脂的结合力很强，洗柱时使用较高的流速。然后停止柱流，4℃放置12 h以上。最后用缓冲液1将目的蛋白洗脱收集，大约收集8～10管，每管5～8 mL，目标蛋白大多在一个柱床体积被洗脱，可以通过检测280 nm下的吸光值或Bradford法检测蛋白浓度。随后对目的蛋白的物理化学性质进行测定。

5 讨论

本实验中涉及步骤较多，时间跨度需2－3周时间，因此较适合作为研究生专业综合实验课程使用。本实验过程中涉及一系列分子生物学的基本操作方法，可以综合锻炼学生的实验技能。在实验教学过程中，教师可引导学生自主设计实验，在一定范围内对实验内容进行调整。如目的蛋白可根据学生的兴趣和实验条件，使用PCR方法扩增基因。

本实验使用单柱一步纯化蛋白的方法，无需蛋白酶切割即可将目的蛋白与融合蛋白分离。对于不同蛋白的诱导表达，时间和温度可根据实际情况(可溶性、稳定性和表达量)进行调整。对于很多不稳定或37℃不溶的蛋白，则采用20～25℃振荡培养6 h或12～15℃振荡培养20 h的条件，诱导蛋白可溶表达。此外，该方法产生的目的蛋白可带有N末端的Cys和或C末端的硫酯键，可以进行蛋白的标记、连接和环化［7，8］。采用MESNA(2-mercaptoethanesulfonic acid)诱导内含肽裂解，目的蛋白C端带有活化的巯脂基团，可与N端为半胱氨酸的多肽进行连接。通过连接反应将非编码的氨基酸片段或标记物连接到已表达及纯化的蛋白序列上。

［1］ Shah N H，Dann G P，Vila-Perelló M，et al.Ultrafast protein splicing is common among cyanobacterial split inteins:implications for protein engineering［J］.Journal of the American Chemical Society，2012，134 (28):11338－11341.

［2］ 李 燕，张 洁，卢 琳，等.内含肽介导的蛋白质亲和纯化［J］.江西科学，2013，31(4):453－455.

［3］ 赵仲麟，顿文涛，苏同福，等.内含肽介导的绿色荧光蛋白纯化［J］.河南农业大学学报，2011，45(5): 581－584.

［4］ Southworth M W，Amaya K，Evans T C，et al.Purification of proteins fused to either the amino or carboxy terminus of the Mycobacterium xenopi gyrase A intein［J］.Biotechniques，1999，27:110－120.

［5］ Zhao Z L，Lu W，Dun BQ，et al.Purification of green fluorescent protein using a Two-Intein system［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2008，77:1175－1180.

［6］ Sambrook，RusseⅡ.分子克隆实验指南第三版［M］.北京:科学出版社，2008.

［7］ 赵仲麟，袁 超，朱 伟，等.内含肽介导的蛋白连接技术及其应用［J］.生物技术通报，2011，(11):70－73.

［8］ Xu M Q，Evans T C.Intein-mediated ligation and cyclization of expressed proteins［J］.Methods，2001，24: 257－277.