实验室内质量控制与食源性致病菌盲样分离鉴定

蔡剑辉，李贻汉，何小媚 (广东省深圳市龙华新区疾病预防控制中心，广东 深圳 518109)

能力验证是检查实验室内部质量控制是否有效的一项重要活动，在提高实验室检验水平和发现实验室存在问题，保证微生物检验质量等方面均有重要意义。为此本中心检验室参加了湘粤两地疾控系统2012年度食源性致病菌能力验证活动，取得满意结果。现将实验室内质量控制与盲样分析结果报告如下。

1 实验室内质量控制

1.1 仪器设备监控:水浴箱、培养箱按要求调至所需温度至±1℃范围内。生物安全柜经计量部门检定合格，每天开始前检验并做好记录。

1.2 高压蒸气灭菌器:每次清毒时放置化学指示胶带，以条带显色为灭菌符合要求［1］。

1.3 对所有自配培养菌和商业成品培养基都做了无菌记录，并用阳性菌株和阴性菌株进行验证试验，达到预期要求方可使用。

1.4 诊断血清和染色液:都用阳性标菌株和阴性菌株进行验证，并做好记录，每次使用血清前，观察是否透明，色泽是否浑浊。

2 盲样检验方法及步骤

2.1 质控样品:半固体样品1支，编号为G－16，要求进行沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、腊样芽胞杆菌、大肠埃希菌O157、单核增生性李斯特菌检验。

2.2 检验依据:食品微生物学检验国家标准检验方法和卫生防疫细菌的检验方法［2－4］。

2.3 培养基及试剂:营养肉汤、GN增菌液、Sc增菌液、TTB增菌液、7.5%NaCl肉汤、改良EC肉汤、LB1增菌液、LB2增菌液、血平板、普通营养琼脂、HE琼脂、XLD琼脂、三糖铁培养基、沙门显色平板、CT－MAC琼脂、Baird－parKer平板、大肠埃希菌O157显色平板、MYP琼脂、PALCAM琼脂及各种成套细菌微量生化鉴定盒，均由广东环凯生物科技有限公司提供;所用诊断血清均由宁波天润生物药业有限公司提供。所有培养基试剂、诊断血清均在有效期内。

2.4 方法

2.4.1 用无菌手续打开质控盲样半固体，用接种环混均样品，取样品分别接种营养肉汤、GN增菌液、Sc、TTB、改良EC肉汤、7.5%NaCl肉汤、LB1、LB2进行增菌，结果见表1。

2.4.2 取半固体盲样直接革兰染色，镜检可见革兰阴性杆菌和革兰阳性短杆菌。

表1 增菌结果

2.4.3 取增菌后的培养液，按照食品微生物检验方法，分别接种沙门菌显色平板、HE琼脂平板、XLD琼脂平板、大肠埃希菌O157显色平板、CT－MAC琼脂、血平板、Baird－parker平板、MYP琼脂、PALCAM琼脂，作分离培养，平板分离结果见表2。

2.4.4 从沙门菌显色平板、HE平板、XLD平板上挑取疑似沙门菌菌落接种三糖铁琼脂斜面和营养琼脂平板，经36℃ 18 h培养后，在三糖铁琼脂平板上生化反应为:斜面不变色(－)、底层变红(+)、产气、H2S(+).挑取营养琼脂纯培养物接种沙门菌生化鉴定盒，生化结果为:甘露醇(+)、赖氨酸(+)、尿素(－)、山梨酸(+)、KCN(－)、ONPG(－)、定基质(－)、H2S(+)。沙门菌血清学诊断鉴定结果:A－F多价: (+++)、O9:(+++)、Hp:(+++)、hm:(－)、vi:(－)、Hg:(+++)、盐水对照:(－)，根据革兰染色、平板菌落特点、生化试验、血清学诊断结果，判定从该质控盲样中检出都柏林沙门氏菌。

表2 平板分离结果

2.4.5 根据PALCAM琼脂平板上菌落特点，挑取疑似单核增生性李斯特菌菌落，革兰染色为革兰阳性短小杆菌。用TSA－YE平板划线分纯后，动力试验为伞状生长;接种单核增生性李斯特菌生化鉴定管，生化结果为:葡萄糖(+)、鼠李糖(+)、麦芽糖(+)、VP(+)、七叶苷(+)、甘露醇(－)、木糖(－);溶血试验为:狭小、透明溶血环。根据生化结果、溶血试验，判定从该质控盲样中检出单核增生性李斯特菌。

3 讨论

3.1 质量控制工作在微生物检验工作中地位十分重要，它受到一系列因素的影响。从样品采集、保存运输、检验器材的验收、仪器校准、环境条件、培养基无菌验证和质控、标准菌株和诊断血清的验证，其中任何一环发生偏差，都可能导致最终结果的错误。

3.2 Baird Parker平板是金黄色葡萄球菌分离鉴定的选择培养基。质控盲样在该平板上形成极细小的黑色菌落，但无浑浊带和透明环，要注意与金黄色葡萄球菌相区别。

3.3 此次质控盲样之所以选用营养肉汤、Sc、TTB、GN、7.5% NaCl肉汤、改良EC肉汤和LB1、LB2增菌液，是因为该次质控考核，只要求做沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157、蜡样芽孢杆菌、单核增生性李斯特菌。在实际工作中，应根据工作需要选择不同的增菌培养基，如发生食物中毒，需考虑各种致病菌时，还应当选择如小肠结肠耶尔森氏菌增菌用的改良磷酸盐缓冲液，空肠弯曲菌增用的boltou肉汤，霍乱增菌用的碱胨水，副溶血性弧菌增菌用的3%NaCl碱胨水等增菌液。

3.4 对混合盲样半固体直接涂片，是为了观察细菌形态、排列方式、染色性质、初步判断可能存在的致病菌，为下步检验打好基础。

3.5 显色培养基是近年来发展起来的一种新的培养基，现在大多数细菌都有其对应的显色培养基，如沙门菌显色培养基、弧菌显色培养基、大肠埃希菌O157显色培养基、致泻性大肠埃希菌ECC显色培养基、空肠弯曲菌CCDA显色培养基等，当细菌生长代谢过程中产生特异性酶分解特异性反应底物后，目标菌形成不同颜色的菌落［5］。与传统培养基相比，显色培养基更容易观察，更好辨认，大大提高了微生物检验工作效率，尤其在突发公共卫生事件中，为尽快找查致病因素发挥重要作用。

［1］ 姜瑞霞，张 岩.供应室的感染管理及控制［J］.吉林医学，2013，34(2):359.

［2］ 卫生部GB/T4789－2003食品微生物检验［S］.北京:中国标准出版社，2003:1－35.

［3］ 卫生部GB/T4789－2008食品微生物检验［S］.北京:中国标准出版社，2008:1.

［4］ 卫生部GB4789－2010食品安全国家标准食品微生物检验［S］.北京:中国标准出版社，2010:1.

［5］ 王晓梅.微生物实验室盲样考核质控报告［J］.内蒙古中医药，2013，(6):124.