子宫内膜癌早期诊断的研究进展

闫利红 张志新 周冰侠 陈雪 李向阳 王小娟

·综述与讲座·

子宫内膜癌早期诊断的研究进展

闫利红 张志新 周冰侠 陈雪 李向阳 王小娟

子宫内膜癌，早期诊断；基因突变，DNA甲基化

子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。全球每年约有14.2万女性患子宫内膜癌，4.2万人死于该疾病，且其发病率呈逐年上升的趋势[1]。在我国女性生殖系统恶性肿瘤中，子宫内膜癌的发病率位居第二位。根据临床特点、病理形态和预后因素，子宫内膜癌可分为两种类型[1]：Ⅰ型子宫内膜癌为雌激素依赖型，比例高达80%，多发生于处于绝经期或绝经前期的女性，并多有暴露于无拮抗的内源性或外源性雌激素的病史。Ⅰ型子宫内膜癌多为子宫内膜样腺癌，肿瘤分化程度较好，恶性程度一般较低，其预后也比较好，5年的生存率在74%左右[2]。Ⅱ型子宫内膜癌，是非雌激素依赖型，多发生于萎缩的子宫内膜中，多为浆液性乳头状廇、透明细胞癌等少见肿瘤。该类型肿瘤属高度恶性肿瘤，预后比较差，5年的生存率在27%～42%[3]。 Ⅱ型子宫内膜癌常见于绝经后女性，目前猜测可能与年龄和盆腔放疗有关[2,4]。

1 子宫内膜癌的发病机制

子宫内膜癌的发生过程是内外多种因素相互作用的结果，目前研究较多的主要有相关基因突变以及DNA甲基化模式异常。

1.1 子宫内膜癌细胞中的基因突变 从正常的子宫内膜细胞向肿瘤细胞的转化过程是一个多步骤的渐进过程，其中包括了参与子宫内膜正常维持和发育的多种基因的突变过程。这些重要的基因可以分成三类：原癌基因，肿瘤抑制基因和DNA修复相关的基因。这些基因的突变和异常在两种类型的子宫内膜癌中有所不同。Ⅰ型子宫内膜癌中，细胞多表现为近双倍体的正常核型，并常伴有微卫星序列不稳定性[microsatellite instability(MSI)，占20%～30%]，以及PTEN(占30%～60%)、K-RAS(占10%～30%)、β-catenin(占28%～35%)和PIK3CA(占25%)等基因的突变[5,6]。其中PTEN基因的突变失活被认为是子宫内膜癌发生最早期的事件之一。PTEN基因的失活与微卫星序列不稳定性均可发生在子宫内膜组织形态还未发生异常之前[5]。Ⅱ型子宫内膜癌中，细胞多为非整倍体，Ⅱ型子宫内膜癌的发生常与p53的基因突变和多染色体的杂合性丢失有关[5]。

1.2 DNA甲基化与子宫内膜癌的发生 DNA甲基化作为一个重要的表观遗传过程，可以在不影响基因的序列前提下改变基因的活性。这一反应是由DNA甲基化转移酶完成的。它可以特异性的将甲基基团(-CH3)共价地连接到基因组中的CpG(Cytosine-Guanosine dinucleotide)双核苷酸的胞嘧啶上[7]。目前哺乳类动物中已发现3种DNA甲基化转移酶，分别为DNMT1，DNMT3A和DNMT3B。其中DNMT1主要功能是在细胞分裂时维持新生DNA链的甲基化状态，其对于半甲基化的DNA链的催化活性远高于未甲基化DNA链。而DNMT3A和DNMT3B参与催化DNA的从头甲基化(de novo methylation)，该作用在正常情况下主要发生于胚胎发育的早期，随着分化过程的推进该作用逐渐减少直至消失。在许多肿瘤中均可检测到异常的甲基化模式。尤其是在肿瘤抑制因子启动子区域的异常甲基化会导致这些基因的异常沉默，为肿瘤形成的提供条件[7]。但是，从表观遗传角度看，异常的DNA甲基化常发生于Ⅰ型子宫内膜癌而非Ⅱ型子宫内膜癌，这种甲基化水平的不同可能是由DNA甲基转移酶(DNMTs)的活性在两种子宫内膜癌中的不同造成的。检测发现，DNA甲基转移酶在Ⅰ型子宫内膜癌中活性升高，而在Ⅱ型子宫内膜癌中活性降低[8]。

异常的甲基化模式也能从一个新的角度解释过量暴露于无拮抗的雌激素可以导致Ⅰ型而非Ⅱ型子宫内膜癌。随着暴露于雌激素的增加，关键基因发生高甲基化，从而使得子宫内膜细胞增生并最终癌化[8]。在这种情况下，雌激素作为诱变剂，通过表观遗传途径导致或加速了癌症的发生。在子宫内膜癌早期发生的过程中便存在着DNA的异常甲基化。这一过程可能参与了MSI的诱导(MLH1基因失活后的下游事件)和PTEN基因的失活。但是不同于基因突变，DNA的甲基化是一个可逆过程。之前的研究发现，使用去甲基化化学试剂可以重新激活MLH1基因的表达，从而恢复DNA错配修复的活性[9]。并且，与在遗传水平上失活MLH1基因不同，在表观遗传水平上失活MLH1基因并非“全或无”地影响该基因的表达。相反，该基因可能是在肿瘤发生前期被部分甲基化，而在肿瘤发生过程中被逐渐完全地甲基化，从而被彻底失活[10]。在Ⅰ型子宫内膜癌中，除了PTEN和MLH1基因，其他许多肿瘤抑制基因如MGMT和APC，也可通过突变或高甲基化两种方式失活[8]。并且，之前的研究发现，基因启动子区的高度甲基化是子宫内膜癌细胞中孕酮受体B(PR-B)基因失活的主要模式[11]。而在绝大多数子宫内膜样癌和非典型性子宫内膜增生中，RASSF1A(ras-association domain gens Family 1A)和RARb2(retinoic acid receptor beta 2)基因的启动子是高度甲基化的[12]。RASSF1A基因的主要作用是通过利用Rb细胞周期检测点，抑制cyclin D1的富集，从而诱导细胞周期停滞[13]。而RARb2基因的启动子在多种肿瘤细胞中均被甲基化，从而使其表达沉默，导致细胞增殖能力增加，分化和凋亡能力降低[14]。研究发现，RASSF1A的甲基化与微卫星序列的不稳定性和MLH1基因的甲基化显著正相关，而与K-Ras和/或BRAF的基因突变负相关[14]。这些研究表明，RASSF1A启动子的高度甲基化与K-Ras的基因突变，在激活子宫内膜癌的RAS信号通路的过程中，都起到了重要的作用。

在子宫内膜癌发生过程中，能体现DNA异常甲基化的重要作用的最好例子是MLH1基因的表观遗传失活。MLH1基因的失活可导致MSI的发生，从而被认为是子宫内膜癌发生的早期时间。有科学家之前发现在靠近子宫内膜癌细胞的正常细胞中，常可以检测到MLH1启动子的高度甲基化，证明错配修复基因的高度甲基化是诱导MSI发生的起始步骤[15]。同样，有研究发现在邻近子宫内膜癌细胞的微卫星序列稳定的正常细胞中，RASSF1A和RARb2基因的启动子序列也经常存在着非正常状态DNA甲基化[16]。而且，在这些微卫星序列稳定的正常细胞中，MLH1基因并未发生甲基化或表达水平的下调[16]。这些结果说明DNA的甲基化可能起始于RASSF1A和RARb2基因，随后扩展到MLH1基因的启动子区域，最终导致MSI的变化。虽然现在还不清楚DNA的异常甲基化是子宫内膜癌发生的原因还是结果，但可以明确的是RASSF1A和RARb2基因启动子区域的甲基化应该是子宫内膜癌发生的最早期时间，因为此时子宫内膜细胞在形态上还未发生癌变。

2 子宫内膜癌的诊断

到目前为止，子宫内膜癌的早期诊断还存在很多障碍。诊刮和宫腔镜检查均为有创性操作，而超声的灵敏度比较低。巴氏涂片可以通过收集阴道后穹窿液体进行检测确定子宫内膜的异常。但巴氏涂片检测结果受观察者的主观因素影响；并且，高达50%的子宫内膜癌患者其巴氏涂片检测结果为阴性，而巴氏涂片结果显著异常的患者通常其肿瘤级别和发育阶段较高，并存在复发的高风险性[17]。经阴道超声用于子宫内膜癌的早期诊断前景较好，但其不能用于单独确诊[18]。活检目前仍然是确诊子宫内膜癌的惟一方法。在子宫内膜取样的众多方法中，诊刮的准确度大概从77%到94%，但其取样范围仅局限在60%的子宫腔中。宫腔镜可以直接用肉眼检查子宫腔，但它不能像活检那样确诊子宫内膜癌。其他检测子宫内膜癌的诊断方法包括MRI、PET、术中超声或三维超声，这些方法可以为子宫肌层侵犯程度或有无淋巴转移提供更多的信息。

3 DNA甲基化在子宫内膜癌早期诊断中的作用

到目前为止，有创性的子宫内膜活检依然是诊断子宫内膜病变的金标准。与宫颈癌不同，无创性的巴氏涂片诊断对腺体细胞的异常检测敏感度较低，因此在子宫内膜癌的早期诊断中迫切需要借助现代的分子生物学作为补充手段，而DNA的甲基化检测技术可以被用来作为早期初筛。通过检测阴道分泌物中5个基因(CCh13，HSPA1，MLH1，RASSF1A和SOCS2)的DNA甲基化水平来判断患者患子宫内膜癌的可能性。所有子宫内膜癌患者均表现出3个或更多基因的甲基化[19]，而91%的非子宫内膜癌的其他患者中表现出没有或少于3个基因的甲基化。在对子宫内膜癌患者肿瘤细胞周围正常细胞的分析中，发现RASSF1A和RARb2的启动子DNA甲基化的程度比肿瘤细胞低很多。

4 子宫内膜癌早期诊断的未来研究方向

由于目前仍缺乏准确的子宫内膜癌筛选方法，研究在正常子宫内膜腺体细胞中发生的标志着子宫内膜癌的早期遗传事件和表观遗传事件具有非常重要的作用。例如，之前的研究发现，在正常子宫内膜腺体细胞中，PTEN基因的表达缺失是伴随着子宫内膜癌未来发病的一个信号[20]。这一点强调了通过细胞切片进行免疫组化检测PTEN基因表达的重要性。由于DNA甲基化过程具有不稳定性和杂合性，因而建立多种甲基化标志的诊断或预诊平台可能非常有用。由于活检的准确性，因而活检而非DNA甲基化检测仍是子宫内膜癌早期检测的标准方法。但是，当活检在技术上存在困难的情况下，DNA 甲基化检测可作为初期诊断的另一种方法。并且，活检存在着可能取样未达到癌变区域的局限，在这种情况下，甲基化检测可真实的反映病理情况。

总之，遗传学转变和表观遗传学修饰在子宫内膜癌的演化上起到了关键的作用。理解这些转变和修饰，尤其是在肿瘤前期，可能会对疾病的早期诊断产生有意义的影响。

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