多民族麻醉手术患者血浆丙泊酚浓度的测定及分析

李 莉 李 培 于婵娟 刘亚华 杨 劲，3

1.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第三附属医院麻醉科，新疆乌鲁木齐 830000；3.中国药科大学，江苏南京 210009

丙泊酚即2，6-二异丙基苯酚，又名异丙酚、普鲁泊福，属烷基酚类，是一速效短效静脉麻醉药，在临床应用广泛。 测定异丙泊酚血药浓度，对指导临床合理用药具有重要的意义。 丙泊酚血药浓度的测定方法主要有高效液相色谱法（HPLC）[1-11]、气-质联用（GC/MS）[12]、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[13]。后两种方法的灵敏度较高，所需样品量少，但仪器普及程度不够，难以在基层推广应用。 目前文献报道的HPLC主要有高效液相-紫外检测法（HPLC-UV）[4，6-7，9，11]、高效液相-荧光检测法（HPLC-Flu）[1，3，5，8，10]。 为适应临床药代动力学研究的需要，本实验室研究并建立了用反相高效液相梯度洗脱法测定人血浆中丙泊酚浓度的方法。另外，分析各民族患者的药代动力学特点，以期为新疆多民族地区的临床安全用药提供依据。本研究中95 例丙泊酚诱导麻醉手术患者，包括54 例汉族、32 例维吾尔族、9 例哈萨克族人种，稀疏采样，每例患者3 个采血时间点。 经证明，本方法具有较高的精密度和准确度，已成功应用于几百份血浆样品的测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-6AD 液相色谱仪（北京超越未来科技发展有限公司）；ER-128A 电子分析天平（A&D Deompany，TLD，JAPAN）；超声波清洗仪（500 W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司）；IKA MS3 基本型圆周震荡摇床（广州仪科实验室技术有限公司）；TDL-5A 菲恰尔离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）；HGC-12A 干浴氮气吹干仪（天津市恒奥科技发展有限公司）；pH 计[梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司]。

1.2 药品与试剂

丙泊酚标准品（中国食品药品检定研究院提供，批号：100806-200801，ID：4H01-51DP，纯度99.8%）；卡马西平片（上海中西三维药业有限公司）；乙腈（色谱纯，Sigma 公司）；甲醇（色谱纯，Sigma 公司）；实验用水为屈臣氏蒸馏水；磷酸二氢钾（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；氢氧化四甲基胺（TMAH，10%，分析纯，天津市光复精细化工研究所）；异丙醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；环己烷（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；正丁醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；三氟乙酸（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）。 血样来自于新疆医科大学第三附属医院。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hanbon Science&Technology C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：流动相为乙腈/甲醇混合液-水，其中乙腈-甲醇按80∶20（V/V）的比例配制，作为有机相，水相加1%的三氟乙酸调pH 值到4，进行二元梯度洗脱，0～7 min（50∶50，V/V），7～9 min（50∶50～70∶30，V/V），9～22 min（70∶30，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：272 nm；进样量：20 μL；柱温：40℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 丙泊酚标准储备液的配制 用移液枪精密量取丙泊酚标准品25 μL 于50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得到500.00 μg/mL 丙泊酚标准储备液。 密闭后，于4℃冰箱保存。

2.2.2 丙泊酚系列标准溶液的配制 用移液管精密量取500.00 μg/mL 的丙泊酚标准储备液12.5 mL 于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到浓度为250.00 μg/mL的丙泊酚甲醇溶液。依次逐级稀释，最后得到500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 μg/mL的系列标准溶液。

2.2.3 内标液的配制 取卡马西平片剂20 片，精密称定，研细。 精密称取细粉25 mg 置100 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5 mL 置于25 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

2.2.4 磷酸盐缓冲液的配制 称量磷酸二氢钾1.36 g溶于100 mL 蒸馏水中，配制成0.1 mol/L 溶液。

2.2.5 TMAH 的配制 用移液管精密量取10%（W/W）TMHA 溶液4.7 mL 于25 mL容量瓶中，用异丙醇稀释至刻度。

2.3 样品处理方法

得到的空白全血或含药全血于3000 r/min 低速离心10 min，取上层液即血浆于EP 管中。 取空白血浆或含药血浆1.00 mL 于10 mL 连盖离心管中，分别准确加入50 μL 内标物、1 mL 0.1 mol/L 的磷酸盐缓冲液，5 mL 环己烷∶正丁醇（95∶5）的混合有机溶液。 涡旋振荡2 min，于4000 r/min 低速离心5 min，取上层有机相约4.5 mL 移至另一离心管中，精密加入TMAH稀释液50 μL，涡旋振荡2 min，40℃氮气流吹干。精密加入100 μL 乙腈溶解残余物，涡旋振荡5 min。复溶后，吸取混合液过0.22 μm 的滤膜后，精密吸取20 μL，进样分析。

2.4 专属性试验

在本实验条件下，空白血浆、标准品和内标液、空白血浆加入标准品和内标液、麻醉手术患者血浆样品，经HPLC 测定，得到色谱图（图1）。 由图1 可知，血浆中内源性物质不干扰丙泊酚及内标的测定，本方法具有较高的专属性。内标物和标准品的出峰时间分别为6.2 min 和20.8 min。

2.5 标准曲线的制备

图1 各溶液高效液相色谱图

在10 mL 的连盖离心管中分别加入950 μL 空白血浆，再加入丙泊酚系列浓度标准溶液50 μL，使血药浓度相当于25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.098 μg/mL。 按“2.3”项下方法操作，以丙泊酚峰面积与内标峰面积的比值X 为横坐标，丙泊酚的血药浓度C 为纵坐标进行线性回归，求得回归方程为C=1.5975X-0.0294（r = 0.9998）。 提示丙泊酚的血药浓度在0.098～25 μg/mL 范围内与峰面积有良好的线性关系。 丙泊酚的定量下限为0.098 μg/mL（S/N=3）。

2.6 精密度及回收率试验

在950 μL 空白血浆中分别加入低、中、高3 种浓度的丙泊酚标准溶液50 μL，使其浓度分别为0.20、1.56、12.50 μg/mL，每种浓度6 份，按“2.3”项下方法操作，将丙泊酚峰面积与内标峰面积之比X 代入标准曲线计算丙泊酚血药浓度，以测得值与加入值之比计算方法回收率。 以1 d 内测得的丙泊酚血药浓度计算日内精密度，以连续测定3 d，每天1 次测得的丙泊酚浓度计算日间精密度。 结果见表1。

表1 丙泊酚回收率与日内、日间精密度（）

表1 丙泊酚回收率与日内、日间精密度（）

测定方法 加入量（μg/mL） 测得量（μg/mL） RSD（%） 相对回收率（%）日内日间0.20 1.56 12.50 0.20 1.56 12.50 0.18±0.09 1.55±0.02 12.23±0.40 0.17±0.01 1.61±0.018 11.75±0.68 5.05 1.13 3.25 7.43 1.09 5.79 89.68±0.05 98.84±0.01 98.99±0.02 89.33±0.03 102.98±0.01 93.98±0.03

2.7 血药浓度测定方法的应用

收集新疆医科大学第三附属医院麻醉科于2014 年3 月～2014 年7 月美国麻醉师协会（ASA）评级为Ⅰ～Ⅱ级的择期手术患者95 例，按民族不同分成三组，汉族组54 例，男21 例，女33 例；年龄21～73 岁，平均（50.4±2.3）岁；体重48～85 kg，平均（63.5±8.0）kg。 维吾尔族组32 例，男6 例，女26 例；年龄36～61 岁，平均（49.6±10.3）岁；体重53～81 kg，平均（65.8±12.5）kg。 哈萨克族9 例，男3 例，女6 例；年龄28～64 岁，平均（48.6±9.8）岁；体重50～89 kg，平均（65.9±10.7）kg。所有患者术前肝、肾功能均基本正常。所有患者均于术前30 min静脉注射哌替啶50 mg、氟哌利多2.5 mg、咪达唑仑2 mg、东莨菪碱0.3 mg。 入手术室后开放下肢静脉，静脉注入芬太尼3～4 μg/kg、维库溴铵0.1 mg/kg、丙泊酚2 mg/kg（于30 s 内推入）。分别于给药后0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、120、150、180 min 随机选择3 个时间点，用肝素钠于桡动脉取血3 mL，3000 r/min，离心10 min，取上层血浆于EP管中。 取血浆1000 μL 供HPLC 分析，测定所得浓度作图，结果见图2。

图2 各族药-时曲线散点图和药-时曲线平均值图

3 讨论

3.1 内标的选择

文献报道多采用麝香草酚蓝[2-5，9-10]为内标物，偶见2，4-二叔丁基苯酚[1]、卡马西平[6]、乙基罂粟碱[11]做内标。 本实验最初选取麝香草酚蓝作为内标，但是调整流动相比例、更换流动相等色谱条件不能实现同时将内标物、丙泊酚、血浆中的内源性基质分离的目的。经过尝试，最终选取卡马西平作为内标。

3.2 流动相的选择

文献报道的流动相组成有乙腈-水（69∶31，pH=4.0）[1]、乙腈-0.01 mol/L 磷酸二氢钾水溶液（70∶30，磷酸调pH 值到4）[2]、乙腈-水（65∶35）[3]、甲醇-水（75∶25）[7]、乙腈-水（70∶30，其中水相加1%的三氟乙酸调pH 值到4）[9]、甲醇-水（80∶20）[10]等。经过尝试，最终确定流动相为乙腈/甲醇混合液-水，其中乙腈-甲醇按80∶20（V/V）的比例配制，作为有机相，水相加1%的三氟乙酸调pH值到4。 此外，文献报道的均为等度洗脱，然而在本实验室条件下等度洗脱时，有机相比例较高（超过50%）时，血浆中的内源性基质和内标集中在前5 min 出峰，不能将内标物与血浆中的内源性基质分开；降低有机相比例能实现将同时将内标物、丙泊酚、血浆中的内源性基质分离的目的，然而此时丙泊酚出峰时间太长（超过30 min）。 因此最终决定采用进行二元梯度洗脱，0～7 min（50∶50，V/V），7～9 min（50∶50～70∶30，V/V），9～22 min（30∶30，V/V），在低浓度条件下也可获得较好的洗脱效果，内标和药物出峰时间合理，色谱峰形理想。这是文献中首次出现梯度洗脱法测定血浆中的丙泊酚浓度。 本方法简便、准确、重现性好，灵敏度也可以满足丙泊酚临床血药浓度监测的需要，为群体药动学的研究奠定基础。

3.3 检测方法的选择

丙泊酚血药浓度的测定方法已有广泛的文献报道。 虽然HPLC-MS/MS 有较高的灵敏度、较好的特异性，但是仪器普及程度不够，难以在基层医院推广。HPLC-UV 方法具有较高的普及性，但是由于紫外检测器的特性，往往难以将杂质峰和丙泊酚色谱峰进行有效分离。在选用价格相对低廉的国产色谱柱的前提下，笔者开发的丙泊酚血浓检测方法能够将杂质峰和待测样品峰做到基线分离，对于基层医院应用具有较大的借鉴意义。

3.4 药动学分析

据文献报道，种族是影响丙泊酚药物代谢的重要因素[14-15]，但迄今为止，维吾尔族、哈萨克族人种的丙泊酚的药动学研究还没有完整的资料。本研究纳入了95 例丙泊酚诱导麻醉手术患者，包括54 例汉族、32 例维吾尔族、9 例哈萨克族人种，采用稀疏采样在不同时间点共获取了285 个浓度数据。将各个民族的数据按时间点汇总，绘制药时曲线数据，简单比较药时曲线的趋势和曲线下面积。进一步的群体药代动力学数据分析将在后续的论文中报道。

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