血管内皮生长因子对软骨细胞凋亡的作用

朱世振 邱 波▲ 高明勇 宋其合 门海龙

1.武汉大学人民医院骨科，湖北武汉 430060；2.湖北省新华医院骨科，湖北武汉 430060

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是以关节软骨细胞凋亡和细胞外基质进行性降解为主要病理特征的疾病。OA 的病因尚不完全清楚，研究证实OA 受累软骨和滑膜中已发现多种血管生成介质，其中血管内皮生长子（vascular endothelia growth factor，VEGF）是血管生成的主要调节因子，探讨VEGF 在关节软骨中退变的作用，特别是以VEGF 为靶向的骨关节炎疾病的治疗是研究的热点之一。本实验探讨VEGF 对软骨细胞凋亡，以及对增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达和一氧化氮（nitric oxide，NO）含量的影响，为今后以VEGF 为靶点治疗骨关节炎提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

武汉大学医学部实验动物中心提供的出生1 周龄的SD 级乳鼠10 只，雌雄不分，体重（100±10）g。DMEM/F12 培养基（Gibco），胎牛血清（美国Hyclone公司），胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶（美国Sigma 公司），细胞总蛋白提取试剂盒（武汉谷歌生物），PCNA 一抗，Annexin-FITC 细胞凋亡试剂盒，NO 检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 实验方法

1.2.1 软骨细胞的体外培养和分离 将乳鼠处死后，75%乙醇浸泡，取其膝关节软骨，并无菌条件下移至加有10%胎牛血清的培养基中， 剪碎至1 mm3大小，依次用0.25%胰蛋白酶37℃消化40 min，1000 r/min离心5 min 后，弃上清，用PBS 洗3 遍，再加入0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃消化2 h，细胞接种于DMEM/F12 培养基， 并补充100 mL/L 胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素， 密度为2×105接种于培养板，置于CO2培养箱中培养，待细胞70%～80%融合后，培养基中分别加入不同干预因素。实验分三组，对照组：不加任何处理因素；VEGF 组：10 ng/mL VEGF；C 组：10 ng/mL IL-1β，每组设4 个复孔，连续培养48 h 进行检测。

1.2.2 流式细胞技术检测软骨细胞凋亡 用0.25%胰酶将各组贴壁细胞从培养板上消化并分别收集至2 mL EP 管中，将各组细胞用1 mL PBS 洗涤一遍，最后各组分别加入5 μL Annexin-FITC、10 μL 碘化丙啶，室温避光孵育15 min，上机检测，重复5 次。

1.2.3 Western Blot 法检测软骨细胞PCNA 的表达6 孔板铺软骨细胞2×105孵育过夜， 加入以上干预因素，24 h 后，加入细胞裂解液100 μL 裂解细胞，按常规的Western Blot 操作方法进行，冰上裂解5 min，12 000 r/min 离心5 min，取上清行BCA 蛋白定量；取样品约10 μg 行SDS-PAGE 电泳， 将蛋白转到PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(兔抗PCNA单 克 隆 抗 体，1∶1000)，4℃过 夜；PBS 漂 洗3 次每次10 min，加入HRP 标记羊抗兔二抗(1∶3000)，室温孵育1 h，漂洗3 次，用ECL 显色液曝光，灰度扫描仪进行定量分析。

1.2.4 硝酸还原酶法检测软骨细胞分泌NO 的含量NO 是一种广泛存在于生物体内的小分子物质， 是一种自由基，NO 在体内代谢很快转变为NO2-和NO3-，而NO2-又将很快转变为NO3-， 本法利用硝酸还原酶的特性将NO3-还原为NO2-来检测NO 的含量。根据南京建成公司提供的硝酸还原酶检测试剂盒，通过测定550 nm 处的吸光光度值，对各组细胞上清液中NO 的含量进行检测。NO（μmol/L）=（测定管吸光度值－空白管吸光度值/标准管吸光度－空白管吸光度值）×标准品浓度（100 μmol/L）×样品测试前稀释倍数

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 16.0 对数据进行分析， 正态分布计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD-t 检验。 以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞术检测软骨细胞凋亡情况

对照组软骨细胞凋亡率[（2.83±0.77）%]明显低于VEGF 组[（9.28±2.35）%]和IL-1β 组[（17.14±5.07）%]，三组差异有高度统计学意义 （F = 56.145，P ＜0.01）。进一步组间比较，VEGF 组和IL-1β 组分别与对照组比较，VEGF 组与IL-1β 组比较，差异均有高度统计学意义（P ＜0.01），显示IL-1β 与VEGF 具有促进软骨细胞凋亡的作用，IL-1β 促凋亡作用更明显。 见图1。

图1 各组流式细胞技术检测软骨细胞凋亡结果

2.2 软骨细胞PCNA 蛋白的表达

对照组软骨细胞PCNA 蛋白表达[（1.01±0.11）]明显高于VEGF 组[（0.86±0.24）]及IL-1β 组[（0.72±0.05）]，三组间差异有高度统计学意义（F=91.99，P ＜0.01）。进一步组间比较，VEGF 组与对照组比较，IL-1β 组与对照组比较，差异均有高度统计学意义（P ＜0.01），VEGF组与IL-1β 组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图2。

图2 各组β-actin 以及PCNA 蛋白Western Blot 结果

2.3 NO 含量的检测

软骨细胞上清液中NO 含量VEGF 组[（112.31±12.73）μmol/L]和IL-1β 处理组[（150.02±15.34）μmol/L]明显高于对照组[（49.35±6.68）μmol/L]，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。 进一步组间比较，VEGF 组与对照组比较，IL-1β 组与对照组比较，VEGF 组和IL-1β组比较，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。

3 讨论

研究认为OA 软骨退变与细胞因子、 基质降解酶、细胞凋亡等密切相关。 IL-1β 被认为是介导关节软骨破坏最直接的细胞因子。 IL-1β 可以通过上调诱导型一氧化氮合酶和环氧化酶-2 的表达，诱导NO 和前列腺素E2的产生， 而NO 和前列腺素E2均是促进分解的重要因子。 IL-1β 能够刺激软骨细胞分泌基质金属蛋白酶（metalloproteinases，MMPs），加速软骨基质中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的降解，进而破坏软骨细胞外基质的完整性及组织的内稳态。本研究用IL-1β 诱导软骨细胞以模拟OA 软骨细胞病理学改变，结果显示，与对照组组比较，IL-1β 能刺激软骨细胞，产生大量NO，IL-1β 处理组软骨细胞凋亡率较正常组明显增高（P ＜0.01），显示用IL-1β 诱导的软骨细胞符合OA 体外研究模型， 能够模拟OA 体外软骨细胞的病理学特点[1]。

VEGF 是血管生成的重要介质，研究发现，血管发生参与了OA 的发病机制， 血管发生与OA 滑膜炎、软骨丢失、软骨下骨重塑和骨赘形成密切相关。在众多影响血管发生的因子中VEGF 的作用最为重要。关节软骨细胞表达VEGF 数量增多，导致微小血管从软骨下骨向软骨不断长入。微小血管释放的促凋亡因子可以引起肥大层软骨细胞的凋亡。骨关节炎患者的关节软骨组织中促血管生成因子（如VEGF）的数量明显增加，而抗血管生成因子的数量明显减少，软骨组织血管生成因子和促血管生成因子的平衡被破坏，结果导致血管从软骨下骨长入到关节软骨中，在软骨内成骨中扮演重要角色，从而进一步加剧了骨关节炎的发展[2]。 此外，VEGF 在OA 软骨组织中的表达明显增高[3]。OA 患者的关节软骨组织表达VEGF 的细胞数量明显多于健康对照组[4]。 在OA 模型中发现类似血管翳样组织，彩色多普勒发现OA 关节软骨上的血管翳和组织学观察到的血管增生一致[5]。 VEGF 能够促进MMPs 的分泌，减少基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）的产生，从而改变了MMPs/TIMPs 的平衡， 促进软骨基质降解[6-7]。 Ludin 等[8]发现膝关节腔注射VEGF 能够引起关节软骨退变，导致OA 的发生，认为VEGF 是OA 的重要致病因素。 VEGF 拮抗剂sFlt-1 治疗骨关节炎组软骨细胞凋亡降低， 软骨细胞增殖水平增加， 提示VEGF 能够介导膝关节骨关节炎软骨细胞凋亡，抑制软骨细胞增殖，VEGF 对关节软骨细胞代谢的调节有重要作用[9]。 VEGF 参与了OA 的病理改变过程，在其发病过程中发挥重要作用， 以VEGF 为靶点成为OA的治疗策略之一[10]。

细胞的凋亡，即程序性的死亡，对于细胞正常的生长和更新以及受损伤细胞的移除是十分重要的。正常软骨细胞凋亡发生率较低，骨关节炎关节软骨中有过度的软骨细胞凋亡，凋亡可发生于软骨全层，在OA模型中，可以观察到软骨细胞的凋亡较正常组明显增多[1,11]，而软骨细胞的凋亡是导致OA 软骨细胞减少的主要原因。 OA 患者关节软骨细胞中有典型的细胞凋亡，而且细胞凋亡的数量与OA 分级明显相关，软骨细胞的凋亡与OA 的进展密切相关。 软骨细胞凋亡的机制目前仍不完全清楚。 研究发现NO 是一种重要的诱导软骨细胞凋亡的因子，在OA 的发病机制中起到非常重要的作用[12]。NO 合成酶可以介导软骨细胞产生大量NO，NO 能够导致软骨细胞凋亡的数量明显增加。 OA 软骨细胞凋亡数量与亚硝酸盐产生的水平、OA分级呈明显相关性。NO 的产生能够诱导软骨细胞的凋亡，软骨细胞受到损伤后，抑制NO 的产生可能阻止骨关节炎早期病程的进展，表明NO 可诱发软骨细胞凋亡[13]。 本研究结果显示，IL-1β 处理组和VEGF 处理组软骨细胞的凋亡率较正常组明显增高，显示IL-1β和VEGF 对软骨细胞均有促凋亡作用，IL-1β 的作用更强。同时发现VEGF 和IL-1β 干预的软骨细胞分泌的NO 含量明显高于正常组，提示VEGF 和IL-1β 可能通过增加NO 介导软骨细胞凋亡。

PCNA 是一种分子量为36000， 在细胞周期中参与DNA 复制的蛋白质。 它是DNA 聚合酶的辅助因子，在S 期参与DNA 的复制，并作为细胞增殖状态的重要标志物。本研究结果发现VEGF 组和IL-1β 组中的PCNA 蛋白表达量均低于正常组， 说明VEGF 和IL-1β 有降低软骨细胞的增殖活性的作用。

综上述，本研究结果显示VEGF 能够介导关节软骨细胞凋亡， 抑制软骨细胞的增殖活性，VEGF 可能通过增加NO 介导软骨细胞凋亡。

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