阿茨海默病患者和正常老年人颞叶脑皮质的蛋白质组学分析

耿艳 张红红 胡亚卓 韩志涛 耿淼 蔚文峰 甄里 夏征 王鲁宁 张成岗

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种慢性退行性疾病，发病率高，尤其多发于老年人群，临床表现为进行性的记忆和认知障碍，其病理特征是细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉积所致老年斑和细胞内过度磷酸化的tau蛋白所致神经原纤维缠结，其常见的沉积部位如海马、额叶和颞叶[1-3]。随着技术的发展，研究者们做了很多工作以期通过基因和蛋白标志物来揭示AD分子或细胞水平的信息，为探讨其病因和发病机制提供线索，从而便于AD的预测和临床预防。基因组学因其遗传易感性和不随时间变化的特质，具有一定优势，因此早期进行了很多相关研究。但因未发现合适的特异性或灵敏性标志物，其研究结果并不令人满意。本研究采用相对和绝对定量同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)结合二维液相色谱-串联质谱(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry, 2D LC-MS/MS)的定量蛋白质组学方法[4-6]，以尸检的老年人脑颞叶组织为标本，通过分析AD和正常老年人脑组织中的主要差异蛋白，旨在发现疾病的生物标志物，并试图找到能阐明AD病理生理机制的研究方法。

1 对象和方法

1.1观察对象12例尸检的老年男性颞叶脑组织，年龄78～90岁，取自2005-12-2013-03解放军总医院老年医学研究所老年组织库收集的组织标本。其中正常老年组6例，平均年龄(81.83±3.06)岁，死亡至尸检的平均间隔时间为17.0 h；AD组6例，平均年龄(84.67±3.44)岁，死亡至尸检的平均间隔时间为19.3 h。两组间年龄、尸检间隔时间比较差异无统计学意义。12例老年人生前营养状况均正常。脑组织标本取材后均立即放入-80℃低温冰柜保存。

正常老年人组均排除有神经系统疾病以及可能影响中枢神经系统的疾病、脑血管疾病、嗜酒、药物成瘾和精神方面疾病；AD组的老年人均为临床(由解放军总医院神经内科资深专家通过临床症状、体征、相关实验室检查确诊)和病理(尸检组织通过Aβ、Tau、Ubiquitin和Synuclin 的免疫组织化学染色，由解放军总医院病理科资深专家诊断)两方面确诊的痴呆个体；另外，查阅两组老年人的病史，排除可能影响实验的其他因素。

1.2方法

1.2.1主要试剂与仪器：包括高效液相色谱仪(RIGOL 3220，北京普源精电)、液质联用质谱仪(Eksigent液相-AB SCIEX TripleTOF 5600质谱仪)、iTRAQ试剂盒(iTRAQ Reagent Multi-Plex Kit，Applied Biosystems)、丙酮、氨水(北京化工厂)、尿素(Urea，法玛西亚USB)、二硫苏糖醇 (DTT，法玛西亚USB)。

1.2.2蛋白质提取：分别将两个组的6份组织样本80 μg混合，在液氮条件下研磨成粉末，以1∶5的比例加入裂解液〔8 mol/L Urea，0.1%(质量分数)DTT〕，超声破碎(超声破碎1 s，停1 s，超声破碎1 min)。以40 000g、4℃离心30 min，取上清。以考马斯亮蓝(Bradford)法定量后，每组样本分别取 100 μg蛋白，以1∶3的体积比例加入已预冷的丙酮，-20℃放置2 h后，以20 000g、4℃离心5 min，弃上清，自然风干。

1.2.3iTRAQ标记：分别于正常脑组织样本和AD患者脑组织样本中加入裂解液(dissolution buffer)，溶解蛋白并经Bradford法定量。分别向蛋白溶液中加入胰蛋白酶(trypsin)，分别取80 μg用iTRAQ试剂盒进行酶切标记。正常脑组织样本用115标记，AD患者脑组织样本用117标记，标记后样本合并。

1.2.4肽段分离及鉴定：(1)第一维高pH反向色谱分离：色谱柱：C18反相柱(Agela, C18 色谱柱，250 mm×4.6 mm i.d.，填料颗粒直径5 μm)；流动相A：2%(液体)ACN-98% H2O(氨水调pH 10.0)；流动相B：98%(液体)ACN-2%(液体)H2O(氨水调pH 10.0)；溶剂梯度：5%～8%流动相B，1 min；8%～32%流动相B，24 min；32%～95%流动相B，2 min；95%流动相B，4 min；95%～5%流动相B，1 min；柱温：45℃；流速：0.7 mL/min；检测波长：214 nm。组分收集：每分钟1管，在8～32 min时收集。有效梯度内，共24组分。(2)LC-MS质谱上样：5600参数设置：抽取干的样本，溶解于A液(1.9%ACN/98%H2O/0.1%FA)，12 000 r/min离心(离心半径=3 cm)3 min，取上清采用Eksigent液相-AB SCIEX TripleTOFTM5600质谱仪检测；色谱条件：液相：Eksigent Nano LC 2D plus；富集柱：自制C18，5 μm，ID 100 μm，20 mm Length；分离柱：自制C18,3 μm，ID 75 μm，120 mm Length；流动相A:1.9%ACN+98% H2O+0.1%FA；流动相B：98%ACN+1.9% H2O+0.1%FA；流速：330×10-3μL/min；洗脱条件：5% B 0 min, 5%～12%B 0～5 min, 12%～22% B 5～21 min, 22%～32% B 21.0～31.5 min, 32%～90% B 31.5～36.0 min, 90%～5% B 36～40 min；质谱条件：数据采集时间40 min，喷雾电压2.3 kV；毛细管温度23.92℃；碰撞能量45；采集相对分子质量范围350～1250。

1.3数据分析ProteinPilotTMSoftware Beta (版本：4.2)搜索引擎，数据库为human库；一级误差为10 ppm，二级误差为20 ppm；合并搜库，导出数据用PDST软件分析。选择差异有统计学意义(P<0.05)的结果报告。

1.4生物信息学分析基于iTRAQ定量比值，对蛋白质的定量信息取Log值后符合正态分布曲线，然后利用95%置信区间法则来计算蛋白差异是否具有统计学意义，筛选出存在统计学差异的蛋白质，作为后续分析的备选。通过生物信息学分析工具DAVID[7]对鉴定蛋白进行Gene Ontology (GO)功能注释、功能富集分析及定位分析。GO功能注释包括生物学过程、分子功能以及细胞组分3个方面内容。GO功能富集分析是指利用功能注释工具高通量地对每个蛋白质进行注释，得到实验鉴定蛋白质在各类生物学过程或分子功能上的分布情况，并将该分布与总体蛋白质的分布进行比较，从而确认实验鉴定蛋白质在哪几类生物学过程或分子功能上显著富集(P<0.05)。通过KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)软件对鉴定的蛋白质进行通路分析。

表 1 AD组与正常老年组脑组织表达上调的蛋白质

注：*AD组与正常老年组中同一蛋白含量的比值

2 结果

2.1蛋白质谱鉴定及表达差异分析在正常老年组和AD组中共同鉴定到的蛋白质有3071种，差异蛋白质146种，与正常老年组相比，AD组中有62种蛋白质表达上调(表1)和84种蛋白质表达下调(表2)。

2.2蛋白质功能聚类分析结果如图1所示。从生物学过程来说，在146种差异蛋白质中，有8%涉及细胞呼吸，14%涉及细胞代谢，两者均与AD的能量代谢相关。根据分子功能注释发现，结合功能和结构分子活性相关蛋白所占比例较多。根据细胞成分注释发现，其最主要的为细胞内细胞器相关蛋白，占50%，其中又以线粒体相关蛋白为主，与生物学过程中的细胞呼吸和代谢过程相吻合。

表 2 AD组与正常老年组脑组织表达下调的蛋白质

续表 2 AD组与正常老年组脑组织表达下调的蛋白质

注：*AD组与正常老年组中同一蛋白含量的比值

图1两组差异蛋白的GO功能分类

表 3 各种生物过程相关蛋白质的富集度分析

注：*富集分值最高的前7位；#每个分类中所涉及到的基因数目

进一步对参与各种生物过程的蛋白质进行富集度分析，结果显示细胞骨架蛋白、细胞内细胞器及细胞呼吸和代谢相关蛋白在细胞内显著富集(表3)。所有蛋白质匹配到11条KEGG通路，可信度最高的通路为AD通路(匹配到通路中的基因为7个，P=0.0078)。在此通路中，基因转录翻译的差异蛋白质为：丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、NADH脱氢酶 (亚基Ⅵ、亚基Ⅹ)和细胞色素C氧化酶(COX；亚基Ⅰ、亚基Ⅱ、亚基Ⅲ和亚基Ⅳ)。

3 讨论

AD主要的病理特征包括老年斑和神经原纤维缠结。神经原纤维缠结是由细胞内tau蛋白过度磷酸化所致。tau蛋白磷酸化与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路关系密切[8]。

MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是多种细胞外信号从细胞表面传导到细胞内的重要传递者[9]，这类激酶主要包括细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路、P38MAPK通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路和ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶转导通路等。其中ERK包括ERK1和ERK2，相对分子质量(Mr)分别为44 000和42 000,两者的同源性为85%。MAPK/ERK信号通路有4条激活途径，这些途径的底物包括转录因子、组蛋白、细胞内其他重要的激酶以及K+通道等。这些物质均是学习记忆形成的必要条件。

Feld等研究表明，ERK与长时程增强(long term potentiation，LTP)存在效应关系，而LTP 和学习、记忆过程密切相关，被许多学者命名为“学习、记忆的突触模型”，从而确定了ERK在学习记忆发生机制中的重要地位[10]。

在对可以引起学习记忆功能减退的AD研究中发现，ERK通路也发挥着重要作用。神经元的异常死亡是AD的常见现象。而在神经元死亡的过程中，ERK的含量增加，一方面磷酸化胞浆底物,另一面进行核转移。核转移的ERK发挥着促进细胞死亡的作用。这与该实验结果AD患者的颞叶脑组织中ERK表达上调相吻合。但值得注意的是，在Subramaniam等[11]的研究中，ERK激活促进神经元的死亡与常规细胞凋亡形式有所不同，其细胞死亡的特点为坏死的胞膜损伤和凋亡样核固缩，这提示ERK促进神经元死亡是一种非凋亡式的细胞死亡。

对于老年人，能量代谢异常引起神经元死亡是导致AD的重要原因，这与该研究中与能量代谢相关的蛋白COX和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在疾病中表达降低的结果相吻合。

COX为线粒体呼吸链复合物Ⅳ，是线粒体呼吸链电子传递的终末复合物，由13个蛋白亚基组成，蛋白亚基Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ由线粒体DNA编码，其余10个蛋白亚基由核DNA编码[12]。COX是位于线粒体内膜上呼吸链末端的限速酶[13]，是线粒体呼吸链氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPH)过程中的关键酶，把氧化还原反应中的能量通过氧化磷酸化转变为含高能磷酸键的ATP。该研究发现AD患者脑组织COX表达显著下降。这与既往研究结果相一致[14-16]，由此导致呼吸链复合体Ⅳ活性改变，细胞线粒体能量代谢障碍，葡萄糖摄取和ATP产生减少。ATP轻微减少时导致氧化应激性细胞损伤，当其减少到不能满足神经元正常生理功能所需时，会引起神经元功能异常,甚至细胞死亡。再者，AD患者细胞色素氧化酶表达降低，使线粒体呼吸链损伤，进而导致活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生增加，而ROS又能激活β-分泌酶和γ-分泌酶，进而促进淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)分解为Aβ，而Aβ可损伤线粒体，进一步导致 ROS 产生增加，形成恶性循环[17]。第三，Du等[18]研究表明，COX表达降低所致线粒体损伤可引起天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate-specific proteases，caspase) 依赖性途径和凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factors，AIFs) 参与的 caspae 非依赖性途径，导致线粒体外膜破裂，引起钙离子和一系列凋亡相关因子释放，启动细胞的线粒体凋亡途径。总之，COX表达下降可能是AD导致中枢神经系统功能障碍的机制之一。

另一种在细胞中与能量代谢相关的蛋白NADH，其为线粒体呼吸链复合物Ⅰ，Mr大约980 000，由45～46个蛋白亚基组成。NADH为介于三羧酸循环和线粒体内膜之间的主要媒介物，参与细胞新陈代谢和能量反应的重要辅酶。其功能主要有3方面:其一，NADH能够加强机体抗氧化能力[19]，这主要通过清除和减少氧自由基对机体的组织细胞损伤起作用；其二，NADH参与细胞氧化还原反应，调节组织细胞受体的表达和信号传递；第三，NADH作为参与能量代谢和呼吸链电子传递的重要辅酶，1分子NADH可产生3分子ATP，ATP耗竭可引起细胞死亡或凋亡[20]。该实验中，NADH在AD患者颞叶组织中表达降低，上述三方面的功能均受到影响，ATP生成减少，当其减少至低于大脑神经元维持正常生理功能所需阈值时，神经元可能因ATP不足而引起细胞死亡或凋亡。神经元死亡发生在颞叶、额叶和海马等部位时，可促进AD的进展。

综上，该研究应用iTRAQ及2D LC-MS/MS技术，通过对正常老年人和AD患者尸检颞叶脑组织差异蛋白质进行分析，发现两组中差异表达蛋白质共146种，在疾病组中上调蛋白质62种，下调84种，其中能匹配到可信度最高的AD通路中的蛋白质有7种，概括为：表达上调的MAPK1、下调的NADH和COX。MAPK1在疾病中高表达促进神经元的细胞死亡，而NADH和COX均为细胞呼吸链的组成成分，其表达下调，使线粒体呼吸链损伤，能量代谢障碍，引起神经元功能异常或死亡。总之，这3种蛋白质表达的变化均与AD的发生密切相关，这为AD疾病的预防或后续治疗等相关研究提供了线索。

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