Mtx1和Cry4Ba毒蛋白基因工程研究进展

孙强，杨丽丽

（黑龙江八一农垦大学，大庆 163319）

自从20世纪40年代化学杀虫剂广泛应用以来，化学防治逐渐成为蚊虫防治的主要方法，但是长期大量的使用化学杀虫剂，不仅对环境造成了严重的污染，给人类的生活、健康带来了严重的伤害，蚊虫抗药性也随之出现，其案例在世界各地大量报道。为此，人们更加关注生物防治，期望找到一条对环境无污染，又可高效灭蚊的防治途径。在已有的生物防治中，主要包括病原微生物灭蚊、捕食性天敌灭蚊和转基因工程蓝藻防治蚊虫，其中，在应用病原细菌灭蚊方面研究较多。20世纪60年代，各国学者分离筛选了多种可用于蚊虫防治的微生物，其中研究最为深入的是球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus，Bs）和苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis israelensis，Bti）[1]。苏云金芽孢杆菌具多种类型的杀虫晶体蛋白，具有杀虫特异性强，对人、畜及非目标昆虫无毒副作用，安全性好，不污染环境[1]。球形芽孢杆菌是一种在自然界中广泛分布、形成亚末端膨大孢子囊和球形芽孢的好气芽孢杆菌。但是由于这两种微生物产生的毒素不同，作用方式不同，其灭蚊的范围也不相同。因此，对近年来球形芽孢杆菌Mtx1毒蛋白和苏云金芽孢杆菌Cry4Ba毒蛋白基因工程研究进展进行综述。

1 球形芽孢杆菌Mtx1研究

球形芽胞杆菌是革兰氏阳性菌，广泛的分布在自然界中。球形芽孢杆菌在营养期可以产生Mtx毒蛋白，Mtx毒蛋白存在于低毒力和部分高毒力菌株中[2]。已报道的有3种类型的Mtx蛋白：Mtx1、Mtx2和Mtx3。Mtx1毒蛋白是一种分子量为100 kDa的可溶性毒素，由870个氨基酸组成。它的N-末端有一个具有G-细菌信号肽特征的序列[3]。

1.1 Mtx1简介

1989年Thanabula等[4]发现Mtx1杀蚊毒蛋白对蚊幼虫具有高毒力，纯化后的Mtx1杀蚊毒蛋白同Bin晶体毒素的杀蚊活性相当。1993年Thanabula等[5]通过研究发现Mtx1毒蛋白在中肠胰蛋白酶的作用下可以分解为分子量为27 kDa和70 kDa的2个片段，并认为它们分别来自于Mtxl毒蛋白的N-末端和C-末端，N-末端能使蚊幼虫中肠细胞内的ADP核糖基部分与蛋白质的氨基酸残基发生连接反应，从而使蛋白质失去功能。C-末端能引起离体培养的蚊虫细胞发生病变，然而，只有当2个片段同时存在时才对蚊幼虫有毒杀作用。1995年Thanabula等[6]通过对球形芽孢杆菌9种不同株系的研究发现，这9种株系孢子细胞中的Mtx1毒蛋白表达非常低，以致无法检测出。其中5种株系在营养生长期能够产生Mtxl毒蛋白，而研究来源于6个DNA同源组的球形芽孢杆菌发现：球形芽孢杆菌可以产生蛋白酶。为了确定该蛋白酶的作用，将Mtx1毒蛋白基因通过使用原始启动子表达在球形芽孢杆菌1693（蛋白酶阴性）多拷贝质粒和球形芽孢杆菌13052（蛋白酶阳性）中。球形芽孢杆菌1693不产生蛋白酶，它的营养生长细胞和孢子细胞均有高水平的Mtx1，而球形芽孢杆菌13052产生蛋白酶，它的Mtx1含量非常低。从而证明该蛋白酶可以降解孢子中的Mtx1毒蛋白。

1.2 Mtx1基因工程研究

作为微生物杀虫剂的球形芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌同样也面临着靶标害虫产生抗药性问题，但苏云金芽孢杆菌的压力较小，因为苏云金芽孢杆菌伴孢晶体中包括多种毒蛋白，多种混合的毒蛋白能够延缓抗药性的产生与发展；球形芽孢杆菌则易使靶标害虫产生抗药性，主要是由于是单因子遗传抗性，这方面资料在法国、印度、巴西、中国等世界各地已有大量的案例报道。如何防止靶标害虫产生抗药性是当前研究热点内容之一，传统抗药性管理策略包括轮换和混合使用苏云金芽孢杆菌与球形芽孢杆菌，而新策略包括基因工程增加杀蚊幼毒素的多样性和增加杀蚊产品的种类，避免杀虫剂抗药性的产生[7]。2003年Boonhiang Promdonkoy等[8]将来自球形芽孢杆菌2297中的Mtx1杀蚊基因在大肠杆菌中克隆表达，分析克隆的DNA序列是由870个氨基酸构成，但Mtx1杀蚊基因在大肠杆菌中表达非常低，或者表达的是融合蛋白。在敲除假定先导序列后，蛋白表达水平提高，敲除后的基因表达的是谷胱甘肽MTX融合蛋白GST-tMtx1，GST-tMtx1对致倦库蚊Culex quinquefasciatus幼虫具有高毒，但是对大劣按蚊（Anopheles dirus）和埃及伊蚊（Aedes aegypti）幼虫低毒。2003年张蓓华等[9]将来源于球形芽孢杆菌SSII-1的Mtx1毒素基因克隆至穿梭载体PBU4上，得到Mtx1插入方向相反的重组质粒PMT19和PMT4，发现含有重组质粒PMT19和PMT4的苏云金芽孢杆菌转化子B-PMT19和B-PMT4在营养体生长阶段对敏感蚊幼和抗性幼虫也具有毒性，毒力与野生型SSII-1相当。2007年杨艳坤等人[10]采用常规生物测定法确定了纯化的球形芽孢杆菌缺失信号肽的97 kDa营养期Mtx1毒蛋白和苏云金芽孢杆菌27.3 kDa的Cry1Aa晶体蛋白对致倦库蚊幼虫的杀虫活性，结果表明：Mtx1和Cry1Aa不同比列的混合物对致倦库蚊的毒力比单独毒素蛋白高，2种毒蛋白对目标蚊幼虫具有协同毒杀作用，在LC98处理浓度下，Mtx1和Cry1Aa按3∶1混合的混合物LT50值比单独使用Mtx1提前了6.36 h，提高了对目标蚊虫的毒力并缩短半致死时间。2009年Ampron Rungrod等[11]将球形芽孢杆菌Mtx1和Mtx2基因克隆到质粒上，并转入大肠杆菌中使其表达，结果发现Mtx1和Mtx2具有协同毒杀作用，同时表达Mtx1和Mtx2的大肠杆菌对埃及伊蚊幼虫的毒力是单独表达其中一种毒素的大肠杆菌的10倍。

2 Cry4Ba研究

苏云金芽孢杆菌在形成芽孢的过程中，能够产生多种蛋白，这些蛋白具有特异的杀虫活性，所以又被称为杀虫晶体蛋白。目前，已发现30多种Bt亚种或血清型对不同种类的蚊虫具有杀虫活性[12]。具有杀蚊活性的蛋白主要有两类，一类为特殊的内毒素即溶细胞毒素，另一类为通常的内毒素晶体蛋白。前者主要包括CytlA，Cyt2Ba，Cyt2Bb和Cyt2Bc，后者主要是 Cry2Aa，Cry4A，Cry4B，Cryl0A，CryllA，CryllBa，CryllBb，Cryl9A，Cryl9B，Cry20Aa和Cry27A[13]。

2.1 Cry4Ba作用机理和结构

Cry4Ba 是从苏云金球形芽孢杆菌以色列亚种中分离获得，对伊蚊和按蚊的幼虫具有较好的毒杀作用。Cry4Ba合成形式为二元毒素，分子量为130 kDa。Cry蛋白杀虫的主要过程为：伴孢晶体在昆虫幼虫中肠中由于碱性消化液的作用而溶解，释放原毒素蛋白。原毒素在中肠蛋白酶作用下进一步降解为活性毒蛋白。昆虫中肠刷状缘膜囊泡细胞膜表面受体与毒蛋白结合，毒蛋白寡聚化并插入中肠细胞膜形成离子通道或孔，敏感细胞的渗透平衡被破坏，导致肠道细胞发生肿胀与自溶。最终导致蚊虫死亡[14-15]。

Cry晶体蛋白在三维结构上有很大的相似性，都是由3个结构域组成。2005年Boonserm等[17]测得了Cry4Ba晶体结构。Cry4Ba的domain I大约由298个氨基酸构成，负责离子通道的形成，Cry4Ba的domain I是由两性的α3～α7 5个螺旋构成的螺旋束，α5的疏水性最强。α3，α4，α6和α7围绕α5逆时针方向排列，N端的α1～α2b由于晶体形成过程中的水解作用而缺失，α1～α2b这3个螺旋对于Cry4Ba的毒力没有明显的作用。Cry毒素的domainⅡ大约是由205个氨基酸构成，是受体结合位点，同时是Cry毒素杀蚊专一性和受体特异性结合的关键因素。Cry4Ba的domainⅡ是由3个反向平行的β折叠片构成，其中2个β折叠片形成希腊钥匙拓补结构，另外一个β折叠片与螺旋结构形成第二个希腊钥匙拓补结构。domainⅡ顶端有3个loops结构，loop1大约由3个氨基酸构成，loop2大约由4个氨基酸构成，loop3大约由16个氨基酸构成。这3个loops结构形成一个类似于免疫球蛋白的抗原决定区。Cry4Ba的loops结构决定了其对库蚊的毒力。loop结构在决定杀蚊特异性方面起一定的作用。domain III是由β折叠片构成的三明治结构，三明治结构包含一个从C-末端β23链延伸的螺旋结构。Cry4Ba的结构和Cry1Aa的结构十分相似[16-17]。

2.2 Cry4Ba基因工程研究

2001年孙钒等[18]将Cry4Aa、Cry4Ba和Cry11Aa基因转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株4Q7中，Cry4Aa、Cry4Ba和Cry11Aa基因成功表达，转化菌株产生伴孢晶体。转化菌株对敏感、抗性致倦库蚊和白纹伊蚊（Aedes albopictus）幼虫的生物测定结果显示：Cry4Aa、Cry4Ba和Cry11Aa毒蛋白对库蚊和伊蚊的毒力较低，二元毒素抗性库蚊幼虫对苏云金芽孢杆菌杀蚊毒素蛋白无明显的交叉抗性。同年孙钒等[19]将Cry4Ba与二元毒素克隆在穿梭载体上，并将其转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株中，转化菌株Bt-BW611成功表达Cry4Ba毒蛋白与二元毒素，研究发现Cry4Ba毒蛋白与二元毒素具有协同作用，表达Cry4Ba与二元毒素的菌株其毒力是只表达一种毒素菌株毒力的40倍。2003年Abdullah等[20]将Cry4Ba domain II的3个loop结构的氨基酸替换，检测突变体蛋白对埃及伊蚊、四斑按蚊（Anopheles quadrimaculatus）、致倦库蚊、尖音库蚊（Culex pipiens）4种蚊虫的毒力。loop1和loop2突变后，Cry4Ba对埃及伊蚊和四斑按蚊没有活性；loop3突变后，Cry4Ba毒蛋白对致倦库蚊和尖音库蚊活性增大，而对埃及伊蚊和四斑按蚊的活性没有改变，证明将短变量序列引入到loop结构中，可以增强Cry杀蚊毒蛋白的活力。2005年Boonhiang Promdonkoy等[21]将Cry4Ba和cyt2Aa2基因转入到大肠杆菌中，表达Cry4Ba毒蛋白的大肠杆菌对埃及伊蚊幼虫具有毒杀作用，LC50为250 ng·mL-1，但是其对致倦库蚊的幼虫没有毒性。cyt2Aa2毒蛋白对埃及伊蚊和致倦库蚊具有中等毒力，LC50为305 ng·mL-1和250 ng·mL-1；共同表达Cry4Ba和cyt2Aa2毒蛋白的大肠杆菌对埃及伊蚊和致倦库蚊幼虫的毒力显著提高，LC50分别为7 ng·mL-1和20 ng·mL-1，说明Cry4Ba和cyt2Aa2毒蛋白对致倦库蚊幼虫具有协同作用。2006年Zribi等[22]从苏云金芽孢杆菌BUPM97中克隆得到Cry4Ba型基因，命名为Cry4BLB，Cry4BLB与之前发现的Cry4Ba型基因有很大不同，尤其是N-末端domainⅢ上的2个氨基酸的变化，对Cry4BLB特异性和毒力有很大的影响。将Cry4BLB基因转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株中，成功表达了Cry杀蚊毒蛋白，又将Cry4BLB转入含有Cry2A基因的无晶体突变株中，发现Cry4BLB蛋白和Cry2A毒蛋白对尖音库蚊具有协同作用。2010年Pablo Emiliano等[23]研究证明cyt1Aa可加强Cry4Ba的活性，实验中发现cyt1Aa loop结构的β6-αE K198A，E204A和β7-k225A的突变会影响cyt1Aa和Cry4Ba的结合和协同作用。Cry4Ba SI303-304 AA双突变后，发现cyt1Aa与Cry4Ba的结合加强，协同作用减弱，cyt1Aa在二者的协同作用中起关键作用。

3 问题与思考

近几年来人们对Mtx1毒蛋白和Cry4Ba毒蛋白与其他毒蛋白的协同作用以及Mtx1毒蛋白的基因改造和Cry4Ba毒蛋白氨基酸的替换进行了一些研究，但在研究中还有一些关键性问题没能解决，我们总结了以下几个重要方面：（1）Cry4Ba毒蛋白和Mtx1毒蛋白对靶标昆虫具有较高的特异性，在带来安全性的同时，也导致了其杀虫谱过窄的问题；（2）长期大量使用苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌也将导致抗药性的产生；（3）Mtx1毒蛋白易被蛋白酶分解，导致其只在球形芽孢杆菌的孢子中可以检测到，致使杀虫效率降低；（4）Cry4Ba毒蛋白中，不同位置氨基酸的改变对其特异性和毒力具有很大的影响，而我们对其研究程度并不精细。上述内容可作为未来研究的重点，其结果将对更好的开发利用球形芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌防治蚊虫有积大促进作用。

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