来曲唑在子宫内膜异位症治疗中的作用

庞丽娜

（锦州市妇婴医院，辽宁 锦州 121001）

来曲唑在子宫内膜异位症治疗中的作用

庞丽娜

（锦州市妇婴医院，辽宁 锦州 121001）

目的 通过观察芳香化酶抑制剂－来曲唑作用于体外培养的子宫内膜异位症患者在位内膜细胞（Ectopic endometrial cells of women with endometriosis，EE）后芳香化酶及芳香化酶转录刺激因子－类固醇源性因子（SF-1）的表达情况，探讨来曲唑作为芳香化酶抑制剂对子宫内膜异位症（内异症）的作用。方法 以0、0.1、1、10、100 nmol/L浓度的来曲唑对体外培养的子宫内膜异位症者的在位内膜细胞（EE）分别进行刺激。72 h后采用RT-PCR法从核酸水平检测Aromatase和SF-1的mRNA表达情况。结果 不同浓度的来曲唑均可明显抑制细胞内Aromatasem RNA及SF-1mRNA表达，与空白组比较有显著性差异（P＜0.05）；且抑制作用呈浓度依赖性。结论 芳香化酶抑制剂－来曲唑对内异症在位内膜细胞具有明显抑制EE细胞内芳香化酶及其转录调节因子SF-1的与mRNA表达。

来曲唑；子宫内膜异位症；芳香化酶

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 组织来源：EE内膜标本取自2010年8月至2011年8月在锦州市妇婴医院妇科，因子宫内膜异位症巧克力囊肿接受手术的20例患者，年龄在22～44岁；患者均无内科合并症，月经规律，周期5～7/27～32 d，无其他免疫、代谢性或内分泌性疾病，手术前3个月内未接受雌激素，孕激素或雄激素治疗。研究组年龄为（34.9±5.9）岁，对照组年龄为（37.2±6.1）岁，统计学比较无显著性差异（P＞0.05）。

1.1.2 在位内膜的采集：于月经周期第7～10天取标本，病理检查证实内膜均为增殖期，内膜采集方法为无菌留取手术切除的子宫内膜或术中刮宫获得的内膜。所得标本均在手术获得后0.5 h内置于冰浴的F-12/ DMEM混合培养基（FD）中。24 h以内进行细胞原代培养处理。

1.2 方法

1.2.1 建立细胞模型：①子宫内膜细胞的分离与原代培养：对EM患者的在位子宫内膜（简称在位内膜eutopic endometrium EE）细胞进行分离培养，参照Noble等[1]的分离、培养方法，略有改动。②共培养子宫内膜腺上皮及间质细胞铺满整个培养瓶底面时，应及时进行传代、冻存与复苏。③子宫内膜腺上皮及间质细胞的纯度鉴定：上述细胞经倒置显微镜观察：进行腺上皮细胞与间质细胞的形态学差异比较，并摄影；对细胞免疫化学进行鉴定：共培养的间质细胞及腺上皮细胞分别用波形蛋白Vimentin抗体及细胞角化蛋白cytokeratin进行免疫染色，采用不加任何一抗者为阴性对照。

1.2.2 半定量逆转录聚合酶链反应（Semiquantitative RT-PCR）检测来曲唑对EE细胞芳香化酶及其转录调节因子SF-1mRNA水平的影响：引物设计与合成：从Genebank中检索芳香化酶（Aromatase）、sF-1及GAPDH的基因序列，结合文献[2]选取引物序列，引物自身之间及与GAPDH之间不存在互补配对现象。

1.2.3 实验方法

①将EE细胞以2×105/mL的密度接种于面积为75cm2培养瓶中。置95%空气，5%CO2，37 ℃温箱培养；待细胞生长接近铺满瓶底时，换用10%FBS培养液继续培养24 h；24 h后，用0、0.1、1、10、100 nmol/L浓度的来曲唑对体外培养的内异症患者在位内膜细胞（EE），分别进行刺激。每间隔24 h换液一次，72 h后终止实验；72 h后，收集细胞，提取细胞总RNA，冷却后于-70 ℃保存。②进行RNA纯度鉴定。③根据cDNA first chain amplification system说明书，建立20 μL的反应体系进行逆转录。④确定PCR扩增条件，据此，确定各实验循环数。⑤PCR扩增。⑥PCR产物的电泳及半定量。

1.2.4 统计学处理：数据经SPSS12.0统计软件处理，计量资料数据用（）表示，进行t检验和方差分析。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 子宫内膜异位症患者内膜腺上皮细胞与间质细胞形态学特点

①倒置相差显微镜下可发现，间质细胞体积比腺上皮细胞明显增大，长度变短，呈纺锤状，核不明显，细胞与细胞之间呈平行排列；腺上皮细胞轮廓清晰，外形似蝌蚪，核较大而且明显，细胞间有小丝状物相互连接，且常围绕成细胞小团。间质细胞大而不规则。内异症内膜细胞与非内异症内膜细胞在形态学特点上差别在于：非内异症内膜细胞较小，形态规则，排列整齐，具有极性；内异症内膜细胞较大，形态多不规则，排列紊乱，没有极性。②内膜腺上皮细胞与间质细胞的免疫细胞化学鉴定。为了进一步鉴定所培养的细胞及其纯度，分别用上皮细胞特异的细胞骨架蛋白cytokeratin与间质细胞特异的骨架蛋白vimentin的抗体进行染色。腺上皮细胞cytokeratin染色阳性，而vimentni染色阴性；相反间质细胞eytokeratin阴性，而vimentin染色阳性，结果表明：原代培养的子宫内膜腺上皮细胞中，cytokeratin染色阳性占绝大多数，纯度率约90%，间质细胞vimentin染色阳性，纯度率达95%以上。

2.2 RT-PCR检测来曲唑对EE细胞芳香化酶及其转录调节因子SF-1 mRNA水平的影响

所有组织标本均检测到内参照基因GAPDH的稳定表达，证实逆转录所得产物cDNA完整性和PCR反应成功。内参照基因GAPDH mRNA的 RT-PCR扩增产物片段长度为576 bp，目的基因Aromatase mRNA的RT-PCR扩增产物片段长度为264 bp，SF-1 mRNA扩增产物片段长度为340 bp。①来曲唑对内异症在位内膜细胞Aromatase mRNA表达有抑制作用，呈浓度依赖性。见表1。②来曲唑对内异症在位内膜细胞SF-1 mRNA表达有抑制作用，呈浓度依赖性。见表1。③来曲唑对Aromatase mRNA和SF-1 mRNA的表达不同浓度组间比较，P＜0.05差异有统计学意义。见图1、图2。

表1 RT-PCR检测来曲唑对EE细胞芳香化酶及其转录调节因子SF-1 mRNA水平的影响

3 讨 论

内异症患者在位内膜细胞SF-1 mRNA水平异常增高，内异症在位内膜就具有SF-1的异常表达趋势。SF-1能与CYP19基因的启动子Ⅱ结合，启动细胞转录芳香化酶mRNA，进一步表达合成芳香化酶。内异症患者的内膜细胞能表达SF-1，刺激内膜细胞转录与表达芳香化酶，催化内膜细胞合成雌激素，促进内异症的发生发展。这样，当有异常表达SF-1趋势的在位内膜异位到其他组织部位时，其SF-1表达水平进一步增高。SF-1能调节卵巢颗粒细胞的增生与分化，可刺激甾体类酶的表达，在卵巢器官分化形成中起决定作用[3]。促使细胞异常表达芳香化酶，进尔催化合成雌激素，促使局部雌二醇水平增高，子宫内膜细胞增殖、浸润，促进子宫内膜异位症的发展以及局部炎症、免疫反应的发生。因此，我们推测子宫内膜异位症患者在位内膜芳香化酶、SF-1的高表达可能就是子宫内膜异位症患者发生内膜异位的根本原因之一。抑制在位内膜芳香化酶、SF-1的高表达可作为治疗此疾病的新靶点。

图1 RT-PCR检测来曲唑对5组EE细胞芳香化酶mRNA水平的影响

图2 RT-PCR检测来曲唑对5组EE细胞芳香化酶转录调节因子SF-1 mRNA水平的影响

一般认为，芳香化酶抑制剂治疗内异症的机制：一是通过抑制卵巢和卵巢外组织芳香化酶的活性，降低血清和病灶局部雌激素的浓度；二是降低异位病灶局部芳香化酶的表达。本研究实验证实芳香化酶抑制剂可以明显抑制细胞内芳香化酶及其转录调节因子SF-1的mRNA表达。进一步支持内异症发生的“源头理论”或“在位内膜决定论”。

[1] 谭先杰,刘东远,郎景和,等.子宫内膜腺上皮及基质细胞分离,培养作为子宫内膜异位症体外细胞模型的探索[J].现代妇产科进展,2002,11(1):30-32.

[2] 罗辉,吕忠士,史玉霞.芳香化酶在卵巢子宫内膜异位症中的表达及意义[J].实用医学杂志,2003,19(11):1222-1223.

[3] 王化丽,于静,王莲芬,等.细胞色素芳香酶P450在正常,子宫内膜异位症子宫内膜的表达及意义[J].实用妇产科杂志,2003,19(2):95-96.

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：1671-8194（2014）08-0107-02