伤寒沙门菌Mig－14蛋白部分密码子优化后的表达及多克隆抗体制备

张 红，生秀梅，徐顺高，黄新祥，许化溪

（江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212013）

伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhi简称S.Typhi）是一种具有鞭毛的革兰阴性人类肠道致病菌，经消化道感染后可以引起全身系统性疾病——伤寒热［1］.mig－14是S.enterica从S.bongori谱系中分离出来时通过水平转移从大肠埃希菌（Escherichia coli，简称E.coli）中获得，随后II（Salamac）型和IV（Houtenae）型S.enterica丢失该基因，故而，mig－14只存在于I型、Ⅲa型和IIIb型沙门菌的染色体上，是引起伤寒热的致命性感染因素［2］.mig－14是一种独立的致病因子，它的表达受到宿主细胞内环境的影响，在沙门菌感染早期不发挥新陈代谢作用或管家基因的作用［3］，Valdivia等人发现mig－14对沙门菌在宿主细胞内生存有作用［2］.mig－14具有拮抗PB的功能，其作用机制尚不明确.序列分析显示，mig－14与转录调节蛋白AraC家族有一定的同源性［4］，提示它可能是一种调节蛋白.

为了探寻Mig－14拮抗PB的分子机制，本实验室尝试将mig－14基因克隆至表达载体p ET22b（＋），并转入大肠埃希菌JM109中进行表达，但始终得不到表达产物.经密码子偏好性分析发现mig－14基因中含有大量稀有密码子（8%）.密码子偏爱性在原核基因异源表达中是一个很重要的影响因素.一般情况下，异源基因包含的密码子在特定宿主中的利用率越低，该种蛋白的表达量也就越少，而通常采用的解决策略是优化目标基因中的稀有密码子，在不改变氨基酸序列的前提下，将低利用率的密码子替换为宿主常用密码子来提高目标蛋白的表达水平.

本研究首次采用密码子优化策略对mig－14基因在大肠杆菌中进行全序列的基因优化，借助此法，成功克隆表达了Mig－14蛋白周质空间部分（Mig－14－p），并制备了相应的兔抗重组蛋白mig－14－p的多克隆抗体.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 伤寒沙门菌野生菌S.Typhi GIFU10007由日本岐阜大学医学院微生物学教研室馈赠；E.coli JM109（DE3）和原核表达质粒p ET22b（＋）由本实验室保存.

1.1.2 实验动物 雄性家兔2只，由江苏大学实验动物中心提供.

1.1.3 主要试剂与材料 DNA聚合酶r Taq、2.5 mmol d NTP限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ、BSA、DL 2000标准Marker、T4DNA连接酶均为Ta KaRa（大连）公司产品；DNA聚合酶pfu和预染的蛋白标准参照物为Fermentas公司产品；质粒小量提取试剂盒为Axygen公司产品；福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂为Sigma公司产品；IPTG为Promega公司产品.

1.1.4 主要仪器 PCR仪，2720 Thermal Cycler（ABI），凝胶成像分析系统和垂直电泳仪（Bio－Rad），核酸检测仪（NanoDrop），恒温摇床MAXQ 4000（Thermo），冷冻高速离心机：MULTIFUGE X1R（Thermo），JY92－IIDN超声破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）.

1.2 方法

1.2.1 密码子的优化 mig－14基因（897 bp）的密码子在大肠杆菌中的优化根据大肠杆菌中密码子的使用频率利用软件Ge MS［5］进行设计，优化后的密码子未改变氨基酸的序列，密码子优化贯穿于整条基因序列，由南京金斯瑞公司合成.

1.2.2 目的基因的获得 根据合成的mig－14基因序列，利用Oligo6.0软件设计上、下游引物P－mig－14－p－A／B，并分别在引物5′端加接NcoⅠ和XhoⅠ的酶切位点序列，P－mig－14－p－A：GCCCATGGCAGTGAAGATCCAAGAAGTG（下划线为NcoⅠ酶切位点），P－mig－14－p－B：GCCTCGAGCAGCTGGCTGAAAAAGTT（下划线为XhoⅠ酶切位点）.以合成的mig－14基因为模板，P－mig－14－p－A／B为引物，利用高保真DNA聚合酶pfu对目的基因进行扩增.

1.2.3 重组表达载体的构建及鉴定 酚仿－乙醇法纯化后的PCR产物和表达载体p ET22b（＋）经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后，酶切产物经酚仿－乙醇法纯化后用T4DNA连接酶16℃连接3 h，将连接产物热激转化入E.coli JM109，次日从平板上挑取12个菌落接种于含氨苄西林的LB平板上，37℃培养8 h后，将上述菌体和空载体转化菌体收集于含30μL蒸馏水的EP管中，再加入等体积的酚／氯仿／异戊醇（25∶24∶1）混合液，在振荡器上剧烈振荡，离心后取10μL上清，用0.7%琼脂糖凝胶电泳观察质粒大小，初步筛选阳性克隆质粒，提取初筛阳性克隆质粒经过PCR和双酶切验证后，通过DNA测序分析最终确认（测序分析由上海生工生物技术公司完成）.

1.2.4 重组蛋白的表达 分别挑取含重组质粒p ET22b（＋）－mig－14－p和空质粒p ET22b（＋）的E.coli JM109单菌落于2 m L LB液体培养基中（氨苄西林100μg／m L），37℃振摇过夜.次日以1∶100比例转接入20 m L的LB培养液中，37℃振摇至OD600为0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol／L，30℃振摇4 h，冰浴10 min后收集菌体，洗涤后用500μL PBS缓冲液重悬菌液，取出100μL用于全菌蛋白电泳，剩余菌液4℃超声破碎，离心（12 000 r／min，15 min，4℃），取上清和沉淀进行SDS－PAGE电泳.

1.2.5 重组蛋白纯化 按照目的蛋白相对分子量大小配置5%浓缩胶和12%分离胶，不插样品梳上样，按常规方法进行电泳.电泳结束后将胶放置于预冷的KCl（250 mmol／L）溶液中，振摇染色至目的蛋白在胶块上呈现1条白色的条带，将此条带切下，置于PBS缓冲液中漂洗脱去KCl.根据实验需要进一步处理胶条：免疫动物时，将胶条与适量佐剂混合后于冰上充分研磨粉碎，形成“油包水”状即可免疫动物；ELISA包被抗原时，将胶条切成小块后置于EP管，加入少许PBS缓冲液振荡混匀，－20℃反复冻溶3次，4℃，离心（13 500 r／min，15 min，4℃），取上清用于ELISA实验［6］.

1.2.6 Mig－14－p的抗原性分析 将Mig－14－p序列输入计算机，利用Antherprot［7］软件按照Parker et al［8］报道的方法进行抗原性分析.

1.2.7 兔抗Mig－14－p蛋白多克隆抗体的制备

制备足量的乳化抗原，背部皮下多点注射法免疫家兔.初次免疫前采集兔耳缘静脉血液，取血清作阴性对照，第1次免疫后每隔2周免疫家兔，共免疫4次，末次免疫1周后颈动脉放血并获得抗血清.分装保存于－20℃.ELISA法测定血清抗体效价，用免疫印迹法检测抗体的特异性.

2 结果

2.1 mig－14－p基因设计及合成

对来源于伤寒沙门菌野生株S.Typhi GIFU10007的mig－14基因进行密码子分析，发现其存在很多大肠杆菌稀有密码子，如表2－1.推测通过对mig－14基因进行密码子优化，可能会实现Mig－14蛋白的表达.故本研究根据密码子的使用频率（http：／／www.kazusa.or.jp／e／index.html）、GC含量、限制性酶切位点以及编码每一个氨基酸各个密码子所占的比重，使用Ge MS软件，对密码子进行优化［5］.优化前后mig－14的密码子分布如表1所示.

表1 大肠杆菌密码子的使用频率及优化前后mig－14基因密码子的使用频率Tab.1 Codon preference in E.coli and codon usage in the wild type and the optimized synthetic mig－14 gene

2.2 伤寒沙门菌p ET22b（＋）－mig－14－p重组质粒的构建

以合成的mig－14为模板，PCR扩增获得约615 bp的DNA片段，将此片段用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后与表达载体p ET22b（＋）相连，连接产物转化到E.coli JM109，筛选带有阳性克隆质粒的菌株，从中提取阳性克隆质粒p ET22b（＋）－mig－14－p，经PCR和NcoⅠ和XhoⅠ双酶切验证，证明mig－14－p基因已经成功连接到表达载体p ET22b（＋）上（图1）.

图1 p ET22b（＋）－mig－14－p重组质粒的构建Fig.1 Preparation of the p ET22b（＋）－mig－14－p plasmid

2.3 重组蛋白Mig－14－p的表达与纯化

重组蛋白pET22b（＋）－Mig－14－p在大肠埃希菌JM109中成功表达，主要以包涵体形式存在.经过KCl染色，在相对分子量为25×103Da处发现与目的蛋白理论预测值相符的蛋白表达带，利用切胶法纯化该蛋白，从而获得大量的目的蛋白（图2、图3）.

图2 重组蛋白Mig－14－p表达与纯化的电泳鉴定Fig.2 SDS－PAGE analysis of recombinant protein Mig－14－p expression and purification

图3 重组Mig－14－p蛋白KCl染色Fig.3 Recombinant Mig－14－p by KCl stain

2.4 兔抗Mig－14－p蛋白的多克隆抗体制备

Mig－14是一种膜定位蛋白，本实验室尝试表达全长，始终未能获得表达产物，应用Antherprot软件对Mig－14进行抗原性分析，发现Mig－14序列上129～165位间抗原性预测值较高，这一区域位于Mig－14周质空间部分.因此我们表达了Mig－14周质部分，将经KCl染色切胶纯化的Mig－14－p蛋白免疫家兔制备兔抗Mig－14－p的多克隆抗体，ELISA测定纯化后的抗体效价为1∶64000，蛋白质印迹显示多克隆抗体与抗原反应的特异性较好（图4）.

图4 免疫印迹法检测抗体的特异性Fig.4 Western－blotting analysis of the anti－Mig－14－p polyclonal antibody

3 讨论

外源基因密码子的选用对异源蛋白表达具有重要影响，采用宿主偏爱的密码子，因其有较高的与宿主细胞的t RNA水平匹配度，可以提高翻译的效率［9］，而且越来越多的证据表明，同义密码子的改变可通过改变mRNA的二级结构并调节与宿主细胞tRNA水平的匹配度，从而提高异源蛋白的表达量［10－11］.本研究在不改变原Mig－14氨基酸序列的情况下，首次尝试利用系统密码子优化的方法设计合成mig－14基因，成功表达了Mig－14－p蛋白.

本研究利用KCl染色切胶法纯化蛋白，获得了较高浓度的目的蛋白，并成功免疫家兔，制备了相应的多克隆抗体.与传统的纯化包涵体蛋白方法相比，KCl染色切胶纯化法具有以下优点：1）简单易行：省去了多次洗脱亲和层析柱的繁琐工作，操作简单.2）经济实用：无需昂贵的蛋白纯化柱，降低了实验成本.3）快速省时：一次可以纯化大量的蛋白，缩短了实验时间.KCl染色切胶免疫方法的应用为包涵体形式存在蛋白的多克隆抗体制备提供了一种便利方法［12］.

本研究根据优化后的mig－14基因，首先尝试了表达Mig－14蛋白，但是尽管不断优化表达条件，仍未见Mig－14蛋白的表达.而通过Antherprot软件对Mig－14进行抗原性分析，发现Mig－14序列上129～165位间抗原性预测值较高，这一区域位于Mig－14周质空间部分.因此我们表达了Mig－14－p并制备相应兔抗重组蛋白的多克隆抗体，为进一步研究Mig－14的分子功能提供了基础.

［1］ Everest P，Wain J，Roberts M，et al.The molecular Mechanisms of severe typhoid fever［J］.Trends Microbiol，2001，9（7）：316－320.

［2］ Valdivia R H，Cirillo D M，Lee A K，et a1.mig－14 is a Horizontally acquired，host－induced gene required for salmonella enterica lethal infection in the murine model of typhoid fever infect immun［J］.Infection and Immunity，2000，68（12）：7126－7131.

［3］ Valdivia R H，Falkow S.Fluorescence－based isolation of bacterial genes expressed within host cells［J］.Science，1997，277（5334）：2007－2011.

［4］ Gallegos M T，Schleif R，Bairoch A，et a1.Arac／XylS family of transcriptional regulators［J］.Microbiol Mol Biol Rev，1997，61（4）：393－410.

［5］ Jayaraj S，Reid R，Santi D V.GeMS：an advanced software package for designing synthetic genes［J］.Nucleic Acids Res，2005，33（9）：3011－3016.

［6］ 鞠爱萍，吴 亮，沈 进，等.弓形虫棒状体蛋白18的原核表达及鉴定［J］.江苏大学学报：医学版，2013，23（3）：207－211.

［7］ Deleage G，Combet C，Blanchet C，et al.ANTHEPROT：an integrated protein sequence analysis software with client／server capabilities［J］.Comput Biol Med，2001，31：259－267.

［8］ Parker J M，Guo D，Hodges R S.New hydrophilicity scale derived from high－performance liquid chromatography peptide retention data：correlation of predicted surface residues with antigenicity and X－ray－derived accessible sites［J］.Biochemistry，1986，25：5425－5432.

［9］ Lithwick G，Margalit H.Hierarchy of sequence－dependent features associated with prokaryotic translation［J］，Genome Res，2003，13（12）：2665－2673.

［10］ Angov E.Codon usage：Nature＇s roadmap to expression and folding of proteins［J］，Biotechnol J，2011，6（6）：650－659.

［11］ Tuller T，Waldman Y Y，Kupiec M，et al.Translation efficiency is determined by both codon bias and folding energy［J］，Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（8）：3645－3650.

［12］ 姜 静，孙其飞，陈 勇，等.切胶免疫制备腮腺液高丰度蛋白多克隆抗体［J］.北京口腔医学，2007，15（5）：254－256.