高效液相色谱检测血浆伏立康唑浓度研究

雷 玲

(海军总医院药剂科，北京 100048)

伏立康唑作为一种新型高效广谱抗菌药物，在临床抗真菌治疗方面发挥着重要作用。伏立康唑于2002年经美国食品药品管理局批准上市[1]，其抗菌机制主要是抑制麦角甾醇生成，引起真菌细胞膜的完整性遭到破环，导致真菌细胞死亡[2-3]。伏立康唑还具有间接的免疫调节功能[4]。该药抗菌谱主要包括急性侵袭性曲霉菌、侵袭性念珠菌属、足放线病菌属和镰刀菌属等[5-6]。值得注意的是，该药的个体代谢差异较大[7-9]，因此在临床上应对伏立康唑的血浆药物浓度进行检测，实现个体化治疗具有重要的意义。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。本试验利用HPLC对患者血浆中伏立康唑浓度进行分析，旨在为临床用药提供依据、提高其临床药效。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2013年1月至2013年12月在海军总医院感染科室中采用伏立康唑治疗真菌感染的患者60例，根据患者意愿及治疗方案将患者分为口服组40例，注射组20例。口服组中男22例、女18例，年龄18～58(32.6±2.9)岁。注射组中男10例、女10例，年龄18～60(33.5±3.2)岁。所有患者在试验前1个月均未服用任何药物，均于试验前询问病史，进行心电图、血尿常规等检查，合格者纳入试验对象，并签署知情同意书。

1.2HPLC法检测伏立康唑浓度

1.2.1仪器与试剂 Agilent1100型高效液相色谱仪(包括Agilent色谱工作站，四元输液泵，G1316A柱温箱，自动进样器，二极管陈列检测器)(美国安捷伦公司生产)，AB204-A型电子分析天平[梅特勒-托利多(上海)仪器公司生产]，旋涡混合仪(北京踏锦科技有限公司生产，Muti-Tube Vortexer VX-Ⅲ)，TG16-W型离心机(中国湘仪赛特离心机仪器有限公司生产)。伏立康唑对照品(批号：100862-200701)和劳拉西泮对照品(批号:030062)均购自中国药品生物制品检定所，纯度均为100%，其中劳拉西泮对照品作为内标化合物。磷酸二氢钠为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯化水。

1.2.2标准品溶液的配制 劳拉西泮对照品溶液：精密称取劳拉西泮对照品50 mg，置于50 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并稀释至50 mL，制成1000 mg/L的劳拉西泮对照品内标液，将内标液用甲醇稀释为20 mg/L的工作液，置于4 ℃冰箱冷藏备用。伏立康唑对照品溶液:精密称取100 mg伏立康唑对照品，置于100 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并稀释至100 mL，制成1000 mg/L的伏立康唑对照品储备液，置于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.3给药方法 口服组均口服伏立康唑(成都华神集团股份有限公司制药厂，批号:20060223)，每日给药2次，每次4mg/kg，持续用药2周。静脉注射组以4 mg/kg伏立康唑(丽珠集团丽珠制药厂，批号：20070504)+5%葡萄糖200 mL静脉注射，每日2次，持续用药7 d。

1.4HPLC法进行浓度测定

1.4.1色谱条件 色谱柱为ZORBAX Extend-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相：0.1 mol/L磷酸二氢钠-水-乙腈(20 ∶35 ∶45)，流速为：1.0 mL/min，柱温40 ℃，进样量20.0 μL，检测波长为256 nm。

1.4.2血样采集 所有受试者试验前10 h进食清淡食物，禁食过夜，于次日清晨给药，给药后2 h方可饮水，4 h后统一进食低脂食物。采用肘静脉取血的方法分别在给药前(0 h)和给药后0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0 h取血5.0 mL，注入肝素抗凝管中，以离心半径20 cm，3000 r/min离心10 min，取上层血浆置于-65 ℃保存待测。

1.4.3血浆样品处理与测定 精密量取200 μL的血浆样品置于2 mL的离心管中，加入劳拉西泮内标液100 μL，混合均匀，加入100 μL的氢氧化钠溶液(0.1 mg/L)以碱化血浆，用乙酸乙酯-二氯甲烷(75∶25)1.5 mL进行萃取，旋涡振荡5 min，3500 r/min离心10 min，取上清液置于另一个2 mL离心管中真空挥干，用100 μL流动相复溶，进样20.0 μL。

1.4.4标准曲线与方法专属性 取标准空白血浆(上海恒远生物科技有限公司提供)1.0 mL，加入不同体积的伏立康唑对照品储备液，配制浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和10.0 mg/L的系列标准血浆样品，根据HPLC测定的结果，绘制标准曲线，再分别配制伏立康唑的浓度分别为0.2、2.0和8.0 mg/L的低、中、高3种浓度血浆样品各5份，测定日内精密度：1 d内低、中、高每种浓度连续测定5次；日间精密度为3 d内，每日各浓度测定1次；稳定性试验：在1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h对血浆样品进行HPLC检测，观察不同时间色谱行为的差异程度，不同时间点测定值的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<15%时，认为稳定性良好。并计算提取回收率和方法回收率，提取回收率=伏立康唑峰面积/等量伏立康唑对照品溶液峰面积，方法回收率=实测浓度/理论浓度。

1.4.5血液样品的测定 将所有患者经肘静脉采血处理后的样品，按“1.4.1”项下的色谱条件进行HPLC测定，并利用标准曲线计算各时间点血浆中伏立康唑的浓度。药师将上述测定结果及时反馈给主管医师，根据血药浓度值及时调整给药剂量和给药方案。

1.5统计学方法 所有数据均输入Excel数据软件中进行分析处理，并以伏立康唑峰面积与内标峰面积的比值Y与血药浓度X进行线性回归。

2 结 果

2.1标准曲线结果 采用Excel数据软件，得出伏立康唑浓度的线性回归方程:Y=0.5238X+0.002(r2=0.9997)，线性范围为0.1～10.0 mg/L。40例口服组定量下限为0.1 mg/L；20例静脉注射组定量下限为0.12 mg/L。

2.2方法专属性结果 HPLC检测发现伏立康唑色谱峰分离良好、峰形对称，血浆内源性杂质峰不明显，口服组保留时间为5.8～8.2 min，平均保留时间为(7.0±0.9)min；静脉注射组保留时间为6.2～8.7 min，平均保留时间为(7.4±0.9)min。劳拉西泮保留时间为5.2～6.3 min，平均保留时间为(5.68±0.36)min。所取3个浓度的血浆样品，进行方法学考察发现，日内和日间精密度RSD均<5%，表明方法的精密度良好；回收率试验结果显示，方法回收率和提取回收率较好，各浓度下均在80%～120%的范围内(表1)。

图1 口服组伏立康唑面积与与内标峰面积的线性关系

图2 注射组伏立康唑浓度与内标峰面积的线性关系

表1 伏立康唑回收率和精密度实验结果 (n=5)

2.3临床应用结果 40例口服组患者血浆中伏立康唑浓度为1.30～1.82 mg/L，平均浓度为(1.56±0.85)mg/L；20例静脉注射组患者血浆中伏立康唑浓度为1.37～1.87 mg/L，平均浓度为(1.62±0.58)mg/L。

3 讨 论

目前，可以采用多种方法检测生物样本中伏立康唑的浓度，其中主要有高效液相荧光检测法和紫外检测法以及高效液相-质谱联用法[9-12]。本试验采用的HPLC方法检测血浆中伏立康唑的浓度，操作具有方法专属性高、简单实用、灵敏度高、分离效果较好的优点。本试验采用0.1 mol/L磷酸二氢钠-水-乙腈(20 ∶35 ∶45)为流动相，所得峰形对称，伏立康唑色谱峰分离完全，杂峰干扰较小；此外，采用乙酸乙酯-二氯甲烷(75 ∶25)作为萃取剂，不仅所用萃取剂减少，而且分离效果更佳，缩短了样品处理时间。本试验建立的HPLC检测方法准确度好，提取回收率高，日内和日间RSD均符合要求，达到了伏立康唑治疗药物浓度检测要求，为临床用药剂量和给药方案调整提供重要参考依据，有利于实现患者个体化治疗的安全实施。

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