耳用地塞米松热敏性凝胶的制备及性能的检测

王 勤,程雪峰,李 聪,顾 健,敖华飞

(上海交通大学医学院附属第三人民医院耳鼻咽喉-头颈外科，上海 201900)

中内耳疾病包括分泌性中耳炎、自身免疫性内耳疾病及梅尼埃病等，临床常用的治疗方法为全身应用激素，为达到有效药物浓度，需要使用较大剂量，因此会引起全身不良反应。近年来有学者尝试局部用药治疗，但由于鼓室经咽鼓管与鼻腔相通，难以让药物较长时间滞留，大大影响疗效。热敏性凝胶[1-3]具有随温度升高而变成凝胶的特性，可以利用此特点使局部长期保持药物浓度，进而避免反复用药造成鼓室损伤[4-5]。本研究以泊洛沙姆407为基质制备耳用地塞米松热敏性凝胶，并对其体外释放性能进行检测，报告如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 地塞米松(上海楷洋生物有限公司，生产批号：090504)，泊洛沙姆407(poloxamer407，德国BASF公司，生产批号：9003116)，地塞米松对照品(中国药品生物制品检定所，生产批号：10098685)。

1.1.2仪器设备 1/10万电子天平(AE240型，梅特勒-托利多有限公司)，DK-8D型电热恒温槽(上海精宏实验设备有限公司)，88-Ⅰ型定时恒温磁力搅拌器(上海思乐仪器有限公司)，UV-9200型紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)，TK-20A型透皮扩散试验仪(上海锴凯科技贸易公司)，微量离心机(BECKMAN COULTER，美国)。

1.2方法

1.2.1制备地塞米松热敏性凝胶 称取一定量的泊洛沙姆407，加入定量等渗的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)溶液配成浓度为16%、17%、18%、19%、20%的等量泊洛沙姆407溶液,另外称取等质量的地塞米松加入上述各泊洛沙姆407溶液中，使其地塞米松浓度为10 g/L，在恒温磁力搅拌下使上述溶液分散均匀，然后放置在4 ℃的冰箱中冷胀48 h，使凝胶分散均匀，充分溶解膨胀，得到澄清透明溶液。

1.2.2测定相转变温度 同时配制浓度为16%、17%、18%、19%、20%的泊洛沙姆407溶液放于4 ℃的冰箱中冷藏48 h得澄明溶液。取储存于冰箱中的泊洛沙姆溶液和含地塞米松的泊洛沙姆407凝胶溶液，取等质量的溶液分别置于容量瓶中，温度计直接插入容量瓶的溶液中(温度计的玻璃泡需与溶液充分接触)，然后整体置于恒温水浴中，水浴缓慢升温(升温速率为1 ℃/1～2 min)，观察并记录内容物不流动时刻的温度。每份溶液需要测定3次，取平均值。然后根据适合耳用的温度(34 ℃)选择合适的泊洛沙姆407浓度。

1.2.3测定波长的选择 配制浓度为10 mg/L的地塞米松溶液。另外选择释放介质即等渗PBS，在注射用水为空白对照的基础上对波长范围在300～500 nm内进行扫描。

1.2.4绘制标准曲线 将地塞米松对照品25 mg置于25 mL容量瓶中，加入等渗PBS适量溶解(储备液)。分别精密量取溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置于25 mL容量瓶中，并将其稀释至刻度，配成4、8、12、16、20、24 mg/L的溶液。取20μL溶液进样，在特定波长处测定不同浓度的地塞米松溶液的吸光度。

1.2.5测定精密度 按上述方法制备3种浓度(24.0、12.0、4.0 g/L)的地塞米松对照液各3份，置于室温，闭光保存。分别在同一日不同时点间测量5次，计算日内地塞米松吸光度的相对标准差(relative standard deviation，RSD)；再在5 d内分别每日测量1次，计算日间RSD。

1.2.6测定回收率 分别精密量取含地塞米松10 g/L的样品1 mL 6份，置于50 mL的容量瓶中，各精密加入上述制备的含地塞米松1 g/L的储备液3.0、4.0、5.0 mL，加等渗PBS稀释至刻度摇匀(每份浓度各制备2份)；再分别另取上述液体1 mL，以等渗PBS稀释至50倍，混合摇匀。取适量溶液以离心半径6 cm，3000 r/min离心5 min，取上清液测定并记录吸光度的数值。

1.2.7体外测定凝胶释药 采用TK-20A型透皮扩散试验仪，在Franz立式扩散池模型基础上进行测定。将试验仪的水浴箱维持在36.0 ℃，并控制使其保持在恒温状态，转速维持在200 r/min，分别将塞米松热敏性凝胶和等渗PBS加入到给药池和接受池，每隔一定时间取接受池样品1 mL，然后再加1 mL PBS溶液。在等渗PBS为空白对照的基础上，测量吸光度。不同时点间按上述方法进行测量，即可得到地塞米松热敏性凝胶不同时间点的药物累计释放量。

2 结 果

2.1地塞米松热敏性凝胶基质浓度的选择 以最接近人体中耳内的温度34 ℃作为相转变温度筛选的依据，由结果(图1)可知：浓度为17%的泊洛沙姆407溶液在34 ℃时已形成凝胶；地塞米松对泊洛沙姆407的相转变温度影响很小。故选择浓度为17%的泊洛沙姆407作为凝胶基质。

图1 不同浓度的泊洛沙姆407与凝胶温度的关系

2.2体外释放度的测定 测定波长的选择结果显示地塞米松紫外吸收光谱在415 nm的波长处有最大吸收，而415 nm波长处PBS吸收很少，两者能明显分离。故选择测定波长为415 nm。以C(浓度)对A(吸光度)进行线性回归绘制标准曲线得方程为C=44.241A-1.860(r=0.998，n=6)。试验结果表明，在4～24 mg/L范围内地塞米松和吸光度呈良好线性关系。日内精确度(RSD)=1.032%，日间RSD=1.936%，此结果符合方法学要求。回收率结果见表1，结果同样符合方法学要求。

表1 回收率测定结果

RSD：相对标准差

2.3样品体外累计药物释放量的测定 据上述测定结果，选择以浓度为17%的泊洛沙姆407为基质的地塞米松热敏性凝胶进行体外累计药物释放量的测定。如图2所示：药物累计释放百分率和时间呈良好的线性关系，显示为零级动力学特征。并将此累计药物释放曲线进行零级释药曲线拟和，即可得方程y=0.3235x+10.184(r=0.9978)，符合方法学要求。如图2所示两者良好的线性关系也说明样品在体外整个释放过程中无突释，在240 h时药物的累计释放量已经达到90%，整个释药过程完全，具有较好的缓释性和控释性。

图2 地塞米松热敏性凝胶累计药物释放量曲线

3 讨 论

糖皮质激素是治疗中内耳疾病的重要药物，但血-外淋巴屏障严重限制药物到达中内耳组织，为达到有效药物浓度，需要使用较大剂量。由此便带来众多不可避免的不良反应，更是高血压、糖尿病、胃溃疡等疾病的禁忌，限制了其应用，进而限制了中内耳疾病的治疗效果。所以，近年来鼓室内局部用药治疗中内耳疾病成为国内外学者探讨的热点，然而如何在局部保持药物的高浓度长期给药成了研究的关键。

近年来，由于材料科学的发展，出现大量的药物缓释材料，为中内耳疾病的局部治疗提供帮助。热敏性凝胶具有特殊的环境敏感性，即在常规温度下为溶液状态，随着所处外界的温度升高，其能够发生相转化，形成非化学交联型半固体凝胶[3、6]，所以以此作为载药基质，药物即可精确定位到具体的组织内，到达局部用药的目的，这样即可减少对全身其他组织的不良反应，进而可以扩宽地塞米松治疗中内耳疾病的适应证的范围。

利用泊洛沙姆407的特殊性质采用冷溶法制备地塞米松热敏性凝胶，目的是使热敏性凝胶在低温时为流动性较好的液态，随着所处外界温度的升高发生状态的转变，形成半固体凝胶。而本实验的重点是考察不同浓度的泊洛沙姆407的转化温度，以人体中耳内的温度34 ℃作为筛选温度的参考依据，选择合适的浓度的泊洛沙姆407。在此基础上同时考察了含不同浓度泊洛沙姆407的地塞米松热敏性凝胶的相转变温度，以排除加入的地塞米松对相转变温度的影响。

在本实验中以直观简单的倾斜法观察相转变问题，操作简单，结果准确可靠。本研究用等渗的PBS缓冲液进行配置样品，不仅保证了地塞米松的完全溶解，还保证了样品的pH值，减少了药物对鼓室内酸碱平衡的影响。查阅大量的凝胶体外释放的研究文献[7-10]，研究凝胶类药物体外释放[9-11]，在此基础上为了能较好地模拟人体中耳环境，本研究采用其中的立式Franz扩散池来检测凝胶药物的释放，此方法能较好地模拟鼓室相对封闭的环境，通过调节固定的转速来模拟鼓室所处的环境，稳定性好，测定准确。本研究制备的地塞米松耳用热敏型凝胶累计释放百分率接近90%时需要240 h，整个药物释放过程完全，且具有一定的控释作用。配置的地塞米松热敏性凝胶最突出的特点就是黏附力很强，药物表面活性高，增加药物与局部的接触时间和面积，同时减少了用药次数，增加了药物疗效，降低了对局部的刺激。

将泊洛沙姆407作为地塞米松的载药基质制备的地塞米松热敏性凝胶，此体外实验取得了良好的效果，但是否能够在体内有一定的疗效、能否很好地在体内降解值得进一步研究，期待此剂型成为治疗中内耳疾病的理想制剂。

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