普拉格雷含量及有关物质的测定

刘 娥

(荆楚理工学院化工与药学院，湖北 荆门 448000)

普拉格雷，为氯吡格雷类似物，由日本Sankyo公司和美国Eli Lilly公司共同开发，用于治疗动脉粥样硬化血栓和急性冠状动脉综合征[1]，是一种新的前药类抗血小板药物[2],2009年3月其薄膜包衣片首次在英国上市[3]。临床研究发现，普拉格雷较氯吡格雷有更好的抗凝血效果。另外，普拉格雷起效快，疗效好，作用时间持久，不良反应少，也可以很好地预防心血管疾病。目前对于普拉格雷的合成报道较多，但该原料药含量及有关物质分析尚未见报道。为了更好地使用普拉格雷，保证临床用药的质量安全,作者采用高效液相色谱法(HPLC)测定普拉格雷及有关物质含量。

1 实验

1.1 试剂与仪器

普拉格雷标准品，中国药品生物制品检定所；普拉格雷原料药样品,自制;乙腈，色谱纯；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。

UltiMate 3000型高效液相色谱仪(DAD检测器)、TU-1901型双光束紫外可见分光光度计、Milli-Q型超纯水机，美国Millipore公司；CP-224S型电子分析天平，德国赛多利斯。

1.2 方法[4]

1.2.1 色谱条件

色谱柱：C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，柱温30 ℃，检测波长219 nm，流动相为乙腈-磷酸盐缓冲溶液(pH值5.0)(50∶50，体积比)，流速1.0 mL·min-1，进样量 10 μL。

1.2.2 标准品溶液的配制

精密称取普拉格雷标准品，配制成1 mg·mL-1的溶液，作为标准品储备液。精密量取标准品储备液1 mL，加流动相稀释至10 mL,得到标准品溶液。

1.2.3 供试品溶液的配制

精密称取普拉格雷原料药，配制成1 mg·mL-1的溶液，作为供试品储备液。精密量取供试品储备液1 mL，加流动相稀释至10 mL,得到供试品溶液。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

称取普拉格雷标准品适量,加乙腈溶解并稀释配制成浓度为10 μg·mL-1的溶液,经紫外分光光度计扫描,发现普拉格雷在219 nm处有最大吸收。故选取检测波长为219 nm。

2.2 流动相的选择

选取甲醇-乙腈、甲醇-三乙胺及甲醇-磷酸盐缓冲溶液、乙腈-磷酸盐缓冲溶液(不同比例)为流动相进样检测。结果发现，采用乙腈-磷酸盐缓冲溶液(pH值5.0)(50∶50，体积比)，分离效果较好。故选取流动相为乙腈-磷酸盐缓冲溶液(pH值5.0)(50∶50，体积比)。

2.3 分离专属性

取5 mL普拉格雷标准品储备液分别加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液、1 mol·L-1盐酸溶液、30%过氧化氢溶液各2 mL和100 ℃水浴加热1 h。中和后加流动相至10 mL,分别进样10 μL,考察降解物的分离性能，结果见图1。

由图1可知，经酸、碱、高温、氧化破坏后的降解物，均能与主峰普拉格雷较好分离，表明方法的专属性好。

2.4 系统适应性

分别量取空白溶液、标准品溶液、供试品溶液，按1.2.1色谱条件进样测定。结果表明，主峰保留时间6.6 min,拖尾因子为1.02， 与相邻杂质峰的分离度均大于1.5,理论塔板数按普拉格雷峰计算不低于3 000。

2.5 检测限

取普拉格雷标准品,精密称定,加流动相溶解并稀释制成一系列浓度溶液,取10 μL进样，当主成分峰高为最大噪音峰高的3倍时,进样量即为检测限。测定检测限为0.03 μg·mL-1。

2.6 线性关系考察

精密量取普拉格雷标准品储备液适量，加流动相稀释制成浓度(μg·mL-1)分别为3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5系列溶液。各取10 μL进样测定，以峰面积(y)为纵坐标、进样浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线，拟合得回归方程y=1453.4x+3.122,R=0.9999，在0.5～3.0 μg·mL-1范围内，线性关系良好。

2.7 精密度

取普拉格雷浓度为1.0 μg·mL-1的供试品溶液，按1.2.1色谱条件进样，连续进样6次，测定峰面积，主成分峰面积的 RSD为0.8%(n=6) ，相关物质峰面积的RSD为1.2%(n=6)。

2.8 稳定性

取普拉格雷浓度为1.0 μg·mL-1的供试品溶液，按1.2.1色谱条件，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h进样，测定峰面积，供试品溶液主成分峰面积的 RSD为0.3%(n=6)，相关物质峰面积的 RSD 为 0.9%(n=6)。表明供试品溶液在12 h内检测稳定性良好。

2.9 重复性

取同一批供试品溶液，按1.2.1色谱条件进样测定，平行测定6次，RSD为0.65%(n=6)。

2.10 加样回收率

精密量取普拉格雷供试品溶液9份，每份 10 mL，按其浓度的 80%、100%、120%分别加入普拉格雷对照品各3份，按1.2.1色谱条件进样。普拉格雷的加样回收率见表 1。

表1回收率结果(n=9)

Tab.1Result of recovery rate(n=9)

2.11 样品测定

按1.2.1色谱条件测定3批次供试品，按外标法以峰面积计算普拉格雷含量分别为99.5%、99.8%、99.7%。

2.12 有关物质的测定

按1.2.1色谱条件进样标准品溶液，调节仪器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%左右，再量取标准品溶液和供试品溶液，参照有关物质测定方法[5]分别测定，3批次有关物质含量分别为0.265%、0.253%、0.250%。

3 结论

建立了HPLC法测定普拉格雷的含量和有关物质。色谱条件如下：色谱柱为C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，柱温30 ℃，检测波长219 nm，流动相为乙腈-磷酸盐缓冲溶液(pH值5.0)(50∶50，体积比)，流速为1.0 mL·min-1，进样量10 μL。此法操作简便、快速、灵敏、准确，样品处理简便易行，可用于普拉格雷原料药含量测定和有关物质的检测。

[1] 孙志国，侯建，邹强,等.普拉格雷的合成[J].中国医药工业杂志,2009,40(4):244-246.

[2] 段妍琴，陈国华，李素义.合成盐酸普拉格雷的工艺改进[J].合成化学，2012,20(1)：125-127.

[3] 程兴栋,童玲,杨玉雷,等.普拉格雷的合成工艺研究[J].中国新药杂志，2010,19(15)：1314-1316.

[4] 刘雅茹，韩秋月，梁晨.HPLC法测定原料药中硫酸氢氯吡格雷及有关物质含量[J].化学与生物工程，2010,27(8)：92-94.

[5] 米亚娴,吴燕,李华龙,等.反相高效液相色谱法测定巴洛沙星片的含量及有关物质[J].天津药学，2008,20(5)：10-12.