递送系统搭载防龋基因疫苗的研究现状

李 虎，亓 鹏(综述)，刘建国(审校)

(遵义医学院口腔学院，贵州 遵义 563000)

防龋基因疫苗可采用不同的接种方式,如肌内注射、口服、鼻腔滴注、扁桃体和小唾液腺区域皮下注射等，不同免疫方式所产生的免疫效价存在差异，递送系统的作用就是帮助疫苗跨越黏膜屏障，增强抗原的摄取效率，减少抗原的降解。理想的载体材料应具有良好的生物相容性、可降解性、稳定性以及低细胞毒性。

龋病是一种非致死性慢性疾病，患者又以儿童和老年人居多，而且接受性较差。防龋疫苗的研发需要考虑患者的接受程度，因此寻找一种低成本、安全可靠、接种方便的途径就显得尤为重要。目前疫苗一般采用肌内注射或皮下注射的方式增强疫苗抗原的免疫原性，诱导特异的抗体反应，从而产生较大的细胞反应。免疫的同时往往伴有较为强烈的短暂性疼痛，可能引起局部剧烈的炎性反应。通过黏膜途径佐剂诱导分泌特异性S-IgA的免疫应答方式成为研究热点[1-2]。黏膜传递可产生系统性免疫应答，但强度较注射途径弱。目前研究的新型递送系统主要有壳聚糖、水凝胶、脂质体等，其能有效地促进黏膜局部的免疫反应，具有安全、简捷、无创伤等优点，并且能够增强抗原呈递功能，具有免疫佐剂的效应。

1 壳聚糖

壳聚糖是天然多糖类阳离子高分子材料，是一种线性多糖，具有良好的生物可降解性和生物相容性，其毒性低，已广泛应用于药物制剂中。

疫苗口服免疫时，由于胃肠道环境对疫苗抗原的降解作用，常常需要多次免疫，而且易产生免疫耐受；鼻腔黏膜接种疫苗，疫苗通过的距离短，且只能在鼻腔内停留15 min左右，但此途径不受低pH和酶降解的影响。无论是单纯口服接种还是鼻黏膜接种都很难通过上皮屏障，到达微皱褶细胞，从而难以高效刺激产生黏膜反应。壳聚糖作为免疫佐剂与疫苗抗原混合制备成微粒，其表面带正电荷的微粒会延长疫苗抗原在鼻腔的滞留时间，同时也增加抗原对免疫细胞的刺激时间，提高黏膜局部免疫和系统免疫，从而提高疫苗的免疫效果[3]。李宇红等[4]将壳聚糖和防龋DNA疫苗制备成微粒，通过扫描电镜和激光共聚焦显微镜发现其分布均匀，大小一致，直径<10 μm，以免疫组织化学法证明质粒可转染入细胞并能正确表达特异性蛋白，认为其能被微皱褶细胞摄取，对DNA有保护作用。壳聚糖与质粒DNA通过静电力作用，结合形成的纳米粒明显提高了基因疫苗的黏膜免疫效果。疫苗与壳聚糖相混合能够保护抗原免受机体各种酶的降解，促进微皱褶细胞的吸收，不仅能诱导有效的黏膜和系统免疫，还能增强所诱导的免疫反应。壳聚糖本身具有免疫刺激活性，能够增加机体抗病毒能力，提高细胞之间的聚集和活化，增强迟发型变态反应和细胞毒性T细胞反应。

Bolhassani等[5]研究发现，以壳聚糖为载体的疫苗微粒系统可以提高抗原呈递细胞的靶向性，保护疫苗抗原，并在机体内起到缓释的作用。壳聚糖包裹的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和抗癌药物可通过诱导CD8+细胞介导的抗肿瘤免疫反应，促进抗肿瘤作用。将不同浓度的壳聚糖加入到包含抗原的流感病毒亚单位疫苗中(15 mg/L)，对小鼠进行二次免疫，21 d后发现加入0.5%壳聚糖的疫苗能诱导出3～5倍高滴度抗体[6]。将壳聚糖与疫苗混合经腹腔注射免疫BALB/c小鼠后，能够在血清和鼻腔洗液中检测到相关的特异性抗体。壳聚糖作为佐剂能提高小鼠抗病毒攻击的能力，可作为一种新型的递送材料增强疫苗的抗原-抗体反应。

虽然以壳聚糖为递送系统搭载疫苗广泛应用于临床还有待于进一步研究，但其作为黏膜免疫递送系统，为口服防龋疫苗提供了新的思路和借鉴之处。

2 脂质体

脂质体由不同比例的脂质与胆固醇构成，为双分子层的封闭小囊泡。脂质体无毒，可生物降解，通常拥有极低的免疫原性，不会导致宿主变态反应和自身免疫反应。脂质体种类繁多，按其所带电荷可将其分为阳离子脂质体、阴离子脂质体和中性脂质体，按其结构类型又可分为单层脂质体、多层脂质体和多囊脂质体等。阳离子脂质体是一种新型的非病毒基因载体，通常带有正电荷，能够与带有负电荷的细胞膜相互吸引，有助于靠近细胞。脂质体能够与DNA或蛋白质通过静电相互作用，形成小粒径的复活物，有助于细胞摄取，同时能避免被机体内的酶降解，在理论上可以获得更大的佐剂活性和人体安全性。阳离子脂质体可作为很多蛋白药物的黏膜载体，其亦能作为蛋白疫苗的载体[7]。

脂质体能够对特定组织进行靶向聚集。在表面嵌入抗体的脂质体称作免疫脂质体，通过抗原识别介导脂质体与靶细胞结合。在脂质体表面也可以嵌入组织特异性细胞间黏附分子，可以实现细胞水平的药物导向，使脂质内包裹的药物在靶细胞表面释放或通过细胞膜与脂质体膜融合，实现药物在靶细胞胞质的释放。在防龋疫苗的应用中，杨亚萍等[8]利用阳离子脂质体乳剂(CLE)分别包被防龋DNA疫苗(pGJA-P/VAX)和重组变形链球菌表面蛋白(rPAc)疫苗免疫小鼠，用DNA初免，2周后以蛋白加强免疫的策略鼻滴免疫6～8周龄的BALB/c小鼠，结果显示实验组(CLE/DNA初免+CLE/rPAc加强免疫组)能产生较对照组(DNA初免+rPAc加强免疫组)更持久的黏膜免疫反应，同时能增加血清特异性IgG和唾液特异性IgA抗体的水平。杨柳等[9]利用中试生产的LE-pGJA-P/VAX质粒通过与脂质体LE溶液直接混合制备LE-pGJA-P/VAX复合物，通过正负电荷吸引，组装成LE/DNA纳米粒子，经细胞转染证实其可正确表达目的蛋白。

有学者认为将靶向脂质体进行多肽修饰处理后，能够借助受体与多肽配体的相互作用，将脂质体靶向运输到含有配体的特异性受体器官、组织或细胞，同时受体与配体结合可促进脂质体内化进入细胞内[10]。多肽修饰的脂质体能够较好地增加药物的选择性，进一步减少药物对组织或细胞造成的不良反应，提高药物治疗指数。脂质体作为载药体系递送药物具有显著优势，既可免受胃肠道中酸和蛋白水解酶的破坏，又具有一定的靶向性，增加抗原的吸收。但脂质体本身的稳定性、制作成本、脂质体和纳米粒药物动力学以及质量检验等问题还有待于进一步的研究，只有在分子水平解决其运输机制，才能有助于脂质体作为递送系统大范围的应用。

3 水凝胶

水凝胶是在空间上呈三维网状结构的一类高分子材料，因其具有独特的吸水性和良好的生物相容性等优点而备受关注。这类材料除了具有良好的物理化学性质外，还拥有药物释放方面的可控性、生物方面的黏附性以及可降解性等新型递送系统所具备的特性。目前水凝胶已在生物医药基因疫苗、组织工程、功能材料等相关领域广泛应用，尤其是在抗生素、抗体、酶、疫苗、避孕药以及激素等药物传送方面[11]。

目前研究较为热门的是智能型水凝胶，它是一种根据外界环境的刺激而产生不同反应，再进一步进行处理并具有执行功能的高分子材料，目前已应用于多个领域。在医学方面以温度敏感性水凝胶和pH敏感型水凝胶的研究较多见，其能够搭载一些新型药物并能达到在人体内控释、脉冲释放、触发式释放和提高药效的目的。

温度敏感性水凝胶高分子材料对于温度的变化非常敏感，该凝胶具有最低临界共溶温度，其溶胀与收缩性随温度变化并不呈线性，而是在某一温度下水凝胶的体积表现为突然的收缩和膨胀，具体表现为在较低温度下溶胀度较高，在相对较高温度下溶胀度较低。将此类水凝胶作为药物的缓释系统，对机体在不同温度下进行可控性释放的研究具有非常重要的意义。孙佳丽等[12]用化学方法得到了水溶性良好、同时在37 ℃时水凝胶溶胶向凝胶转变时间<10 min的改性材料壳聚糖-单甲氧基聚乙二醇(chitosan-methoxy poly polyethylene glycol,CS-mPEG)；经体外释药实验发现，CS-mPEG水凝胶控释作用较好，亲水能力强，有助于保护蛋白活性不被破坏。吉秋霞等[13]制备壳聚糖-壳聚糖季铵盐/甘油磷酸温敏水凝胶，通过检测其对牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和伴放线杆菌产生的抑制作用，证实它不仅可作为药物载体参与局部缓释系统的组成，同时还可作为活性因子参与杀菌、抑菌。亓鹏[14]通过温敏性水凝胶搭载防龋DNA疫苗免疫SD大鼠，研究发现疫苗在大鼠体内可以起到缓释作用，通过龋齿记分分析，疫苗免疫SD大鼠后能够有效抑制龋齿的发生，同时检测到SD大鼠体内的特异性抗体(S-IgA/IgG)在一段时间内维持较高水平。

人体胃液的pH值一般为0.9～1.5，而肠液为6.5～8.0，利用水凝胶在不同pH值时的溶胀效果不同，能够将药物直接输送到作用的靶细胞或器官，防止在输送过程中被吸收或降解。肿瘤细胞与正常细胞之间的pH值也存在差异，这种水凝胶的研究也为未来口腔肿瘤的治疗提供了新的思路，通过pH值控制药物的释放，确保药物能最有效地到达肿瘤细胞。Kim等[16]在研究新型的甲基丙烯酸-乙二醇共聚物Poly[methacrylic acid-co-poly(mono ethylene glycol),P(MAA-co-MEG)]、聚甲基丙烯酸接枝聚乙二醇Poly[methacrylic acid-grafted-poly(ethylene glycol),P(MAA-g-EG)]等pH敏感型水凝胶时发现，这类水凝胶对胰岛素的包裹超过90%。在碱性条件下，凝胶收缩，胰岛素释放缓慢；当pH升至6.5时，凝胶迅速膨胀，胰岛素释放速度明显加快。这种在中、碱性条件下收缩和溶胀的水凝胶多属于阴离子水凝胶，其能够防止多肽、蛋白类药物被胃液降解，同时因其具有生物黏性和膨胀能力，因而可有效促进药物释放、吸收。络合Ca2+的水凝胶还能够促进载体的透膜吸收，从而有效抑制胰蛋白酶的水解作用[17]。

其他水凝胶包括磁性水凝胶、快速响应水凝胶、葡萄糖敏感型纳米凝胶等。磁性水凝胶一般分为三种结构：①内核为磁性材料、壳为聚合物材料；②内核为聚合物高分子材料、外壳是磁性材料；③内层以及外层都为聚合物高分子材料、中间的夹层为磁性材料[18]。这种性质的水凝胶能够吸附到靶区附近，使靶区很快达到所需的药物浓度，避免药物损耗，加速药效产生，提高疗效，降低总给药剂量；由于绝大部分药物被吸附到局部，相对减少了药物对人体正常组织的损害，特别是降低了对肝、脾、肾等器官的损害。作为防龋疫苗的递送系统，水凝胶拥有独特的发展潜力，可通过口服或鼻滴免疫，其缓释作用能够比较平稳的释放药物，达到一个长期的给药过程。由于水凝胶具有良好的生物相容性，能较好的保护疫苗不被降解，从而提高药物的使用效率。目前水凝胶的研究主要集中在制备工艺的研究上，药物控释、传输理论及应用研究还不够深入，同时因水凝胶力学性能较差等方面的限制，要将水凝胶运用到实际的临床中还有待更深入的研究，但其作为口服防龋疫苗的搭载系统为广大学者提供了新的研究方向，具有很好的应用前景。

4 微球与纳米粒

微球系指药物与适宜的载体材料通过微型包囊技术制得的球形或类球形微粒，粒径为1～250 μm。目前，以聚酯类为载体材料的微球制剂研究较为广泛[19]，其中研究较多的是乳酸-羟乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)，即PLGA微球，PLGA是丙交酯与乙交酯的单体所形成的共聚物，两种单体比例不同，聚合物的结晶度也不同。微球降解属水解反应，降解时间也不相同，但降解产物均为人体正常的代谢产物。目前，微球已经普遍应用于黏膜免疫传递系统，此类材料可以包裹小分子药物以及大分子蛋白或质粒DNA。Mohaghegh等[20]发现，用微球包裹质粒鼻腔给药免疫兔后，免疫组的IgG和IgA抗体水平显著高于对照组，显著提高了免疫反应水平。构建的猪流感DNA疫苗微球，通过黏膜免疫后，可刺激机体产生较强的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫，提示此类免疫递送系统安全性较好[21]。

纳米粒具有生物降解性、生物相容性、靶向性、低毒性、药物定位传递以及能使药物或疫苗抗原长效释放和增强表达的特点，不仅可引起全身系统免疫反应，还可以产生较强的局部黏膜免疫反应，同时由于制备的纳米粒能穿过组织间隙，大小与病原体相当，可通过机体最小的毛细血管，因此可生物降解纳米粒已被广泛应用于药物或疫苗递送系统和基因治疗研究中。Rajapaksa等[22]研究表明，PLGA纳米粒能提高微皱褶细胞的吞噬能力，为纳米粒黏膜免疫递送系统机制的研究奠定了基础。

5 细菌菌蜕

细菌菌蜕是在革兰阴性菌中诱导表达来自噬菌体PhiX174的E基因，导致细胞裂解，形成完整的细菌空壳。细菌菌蜕除了具有组合抗原免疫原性、佐剂效应、还具有靶向性载体的作用，特别适合黏膜免疫及口服免疫。作为新型的非活性疫苗，可诱导机体产生有效的体液免疫和细胞免疫，包括黏膜免疫应答。细菌菌蜕可以作为重组蛋白、核酸以及药物等的递送载体。与常规DNA递送系统相比，细菌菌蜕的装载效率高，在有效保护DNA不被降解的同时，高效介导DNA靶向到抗原呈递细胞，实现基因的高效表达[23]。细菌菌蜕还能够诱导机体产生抗原特异性免疫应答。细菌菌蜕的制备无需剧烈的物理和化学处理，细胞膜保留完整，赋予其天然的佐剂特性，菌蜕可以通过发酵方式生产，且冷冻干燥的菌蜕在室温下可长期保存，不会造成效率的损失。目前相关研究主要集中在细菌菌蜕的装载效率和体外转染效率两个方面。沙眼衣原体重组菌蜕和流感嗜血杆菌重组菌蜕已进入到了临床试验阶段，而防龋用变异链球菌菌蜕方面的研究还未见报道。

6 小 结

国内目前尚无将基因疫苗应用于临床的报道，但基因疫苗对猪流感病毒、猪瘟病毒、鸡的禽流感病毒、牛疱疹病毒以及部分寄生虫的防治已取得了一定的成效。防龋基因疫苗的免疫机制尚不明了，而安全性和药动学也是日后需要研究和探索的重要方面。疫苗递送系统目前大多处于实验室研究阶段，还有许多问题待解决，但其出现给防龋疫苗带来了希望。随着研究的深入，基因疫苗能够根据各自特点和不同的免疫途径搭载相对应的载体，以达到效价最大化。希望在不久的将来防龋基因疫苗可以应用到临床，真正的造福人类。

[1] 梅丽琴,曲云鹏,麻建丰,等.免疫分子佐剂ctxB在pVAX1中的初步应用[J].温州医学院学报,2012,42(1):24-26.

[2] Flores J,DuPont HL,Paredes-Paredes M,etal.Pilot study of whole-blood gamma interferon response to the vibrio cholerae toxin B subunit and resistance to enterotoxigenic escherichia coli-associated diarrhea[J].Clin Vaccine Immunol,2010,17(5):879-881.

[3] 张晓艳,赵凯,侯志勇,等.壳聚糖及其衍生物作为免疫佐剂的研究进展[J].中国新药杂志,2012,21(2):138-143.

[4] 李宇红,樊明文,边专,等.壳聚糖2防龋DNA 疫苗微粒的制备和体外表达研究[J].中华口腔医学杂志,2004,39(6):522

[5] Bolhassani A,Safaiyan S,Rafati S.Improvement of different vaccine delivery systems for cancer therapy[J].Mol Cancer,2011,10:3.

[6] Ghendon Y,Markushin S,Krivtsov G,etal.Chitosan as an adjuvant for parenterally administered inactivated influenza vaccine[J].Arch Virol,2008,153(5):831-837.

[7] Tiwari S,Agrawal GP,Vyas SP.Molecular basis of the mucosal immune system:from fundamental concepts to advances in liposomebased vaccines[J].Nanomedicine(Lond),2010,5(10):1617-1640.

[8] 杨亚萍,刘明谆,闵智鹏,等.阳离子脂质体乳剂增强防龋疫苗黏膜免疫效果的研究[J].口腔医学研究,2011,27(10):849-852.

[9] 杨柳,杨颖,林玉红,等.LE-pGJA-P/VAX黏膜递呈系统的制备及其理化性质评价[J].口腔医学研究,2012,28(3):218-219.

[10] 吴学萍,王驰.多肽修饰脂质体靶向药物递送系统研究进展[J].中国现代应用药学,2010,27(8):681-685.

[11] 尹大伟,周英,刘玉婷,等.水凝胶的最新研究进展[J].化工新型材料,2012,40(2):21-24.

[12] 孙佳丽,蒋国强,丁富新.壳聚糖-mPEG温敏水凝胶载药系统的制备及释药行为[J].清华大学学报：自然科学版,2010,50(6):909-912.

[13] 吉秋霞,邓婧,于新波,等.壳聚糖基温敏水凝胶对牙周常见致病菌的抑制作用[J].上海口腔医学,2009,18(4):397-400.

[14] 亓鹏.温敏型生物降解水凝胶载体防龋基因疫苗不同途径免疫SD大鼠的实验研究[D].遵义：遵义医学院,2011.

[15] 刘庆堂.pH-敏感型水凝胶在多肽和蛋白质药物给药系统研究中的应用[J].当代医学,2011,17(34):136-137.

[16] Kim B,Peppas NA.In vitro release behavior and stability of insulin in complexation hydrogels as oral drug delivery carriers[J].Int J Pharm,2003,266(1/2):29-37.

[17] 陈旭日,陈学刚.新型P(NIPAAm-co-IA)pH敏感智能水凝胶的合成与性能研究[J].化学推进剂与高分子材料,2011,9(2):92-96.

[18] 张鸿儒,刘文涛,何素芹,等.磁性水凝胶研究进展[J].材料导报,2009,23(2):106-110.

[19] Tran VT,Benoti JP,Venier-Julienne MC.Why and how to prepare biodegradable,monodispersed,polymeric microparticles in the field of pharmacy?[J].Int J Pharm,2011,407(1/2):1-11.

[20] Mohaghegh M,Tafaghodi M.Dextran microspheres could enhance immune responses against PLGA nanospheres encapsulated with tetanus toxoid and Quillaja saponins after nasal immunization in rabbit[J].Pharm Dev Technol,2011,16(1):36-43.

[21] Zhao K,Li GX,Jin YY,etal.Preparation and immunological effectiveness of a Swine influenza DNA vaccine encapsulated in PLGA microspheres[J].J Microencapsul,2010,27(2):178-186.

[22] Rajapaksa TE,Stover-Hamer M,Fernandez X,etal.Claudin4-targeted protein incorporated into PLGA nanoparticles can mediate M cell targeted delivery[J].J Control Release,2010,142(2):196-205.

[23] 温晶,寇志华.细菌菌蜕DNA疫苗递送系统研究进展[J].中国人兽共患病学报,2010,26(9):858-861.