PLGF、Flt-1与妊娠期高血压疾病的相关性研究

王 芳，郭凤婵

(1.河北大学附属医院妇产科,河北 保定 071000； 2.河北医科大学第三医院妇产科,石家庄 050051)

妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的多脏器损伤性疾病。该病严重影响母婴健康，是孕产妇和围生儿死亡的主要原因，发病率为7%～12%[1]。近年来的研究表明，胎盘生长因子(placental growth factor,PLGF)与妊娠期高血压疾病的关系密切。本研究检测妊娠期高血压疾病患者PLGF和膜型血管内皮生长因子受体1(Flt-1)蛋白在胎盘中的表达，探讨PLGF及其受体与妊娠期高血压疾病发病的关系及其相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2008年1月至2010年1月河北大学附属医院等多家医院妇产科收治的未发动宫缩即行剖宫产的孕妇60例为研究对象，其中妊娠期高血压疾病40例(轻度子痫前期组20例、重度子痫前期组20例)，年龄23～37(27±4)岁，孕周28+3～39+4(36±3)周；正常妊娠组20例，年龄22～36(26±3)岁，孕周33～41(36.6±0.7)周。各组孕妇均无肝炎、结核等急、慢性传染病史，无高血压病、肾病及心脏病史，无贫血、无巨大儿及胎儿生长受限的发生。三组孕妇的年龄和孕周等一般资料具有均衡性。

1.2仪器和试剂

1.2.1试剂 胎盘Flt-1水平的测定：一抗为Flt-1兔抗人单克隆抗体，由武汉博士德生物公司提供；二抗为葡聚糖-过氧化物酶复合物，由北京中杉生物公司提供.

1.2.2仪器 自动洗板机(芬兰，Labsystems Dragon公司，4MKZ型)，脱水机、包埋机、切片机(英国姗顿公司，Citadel2000)，微波仪(浙江临安电子仪器厂，TMY-781B)，显微镜(日本，BHS，Olympus)，冰箱(中国青岛海尔集团，SC-278L)，加样器(上海医用激光仪器厂，25 μL)载玻片(盐城市耀华玻璃仪器厂，26 mm×76 mm)，图象分析仪(华东理工大学自动化研究所，Version2.0)。

1.3方法

1.3.1胎盘PLGF水平的测定 采用免疫组织化学法进行检测：①从已经平衡至室温的密封中取出所需条板；②分别加入标本及不同浓度标准品(100 μL/孔)，空白孔加标准品稀释液(100 μL/孔)，用封板胶封住反应孔，37 ℃孵育2 h；③自动洗板机洗板4次；④加入生物素化抗体工作液(100 μL/孔)，用封板胶封住反应孔，37 ℃孵育90 min；⑤自动洗板机洗板4次；⑥加入酶结合物稀释液(100 μL/孔，空白孔不加)，用封板胶封住反应孔，37 ℃孵育90 min；⑦自动洗板机洗板5次；⑧加入显色剂(100 μL/孔)，室温避光孵育10～15 min；⑨加入终止液(100 μL/孔)，混匀后即刻用酶标仪测量OD450值(5 min内)。

1.3.2胎盘Flt-1蛋白表达水平的测定 采用免疫组织化学法进行检测：①脱蜡至蒸馏水；②3%过氧化氢甲醇液室温浸泡10～15 min，消除内源性过氧化物酶活性；③抗原修复用高压锅法冒气2 min；④滴加1%小牛血清白蛋白封闭液，室温孵育10～15 min(封闭组织内电荷)，倾去血清，不洗片；⑤滴加一抗兔抗人Flt-1单克隆抗体(效价1∶50)，置于湿盒中4 ℃冰箱过夜；⑥磷酸缓冲液振洗3次，每次5 min；⑦滴加二抗PV6001葡聚糖-过氧化物酶酶复合物，37 ℃孵育60 min；⑧磷酸缓冲液振洗3次，每次5 min；⑨滴加二氨基联苯胺显色剂：磷酸缓冲液4 mL，二氨基联苯胺5 g，H2O 25 μL，显色10 min左右；⑩蒸馏水充分冲洗5次；(11)苏木素复染1 min，酒精梯度脱水，二甲苯透明后中性树胶封片；(12)光镜下观察结果。

1.4判定方法

1.4.1胎盘PLGF结果的判定 按显微镜下切片所见细胞无棕黄阳性颗粒或呈一致黄色与背景一致为0分；核内或浆内可见少量淡黄色颗粒，明显高于背景为1分；核内或浆内可见较多淡黄色颗粒为2分；核内或浆内可见较多淡黄色颗粒为3分[2]。

1.4.2胎盘组织Flt-1染色评分的判定 胎盘组织染色阴性记1分，弱阳性记2分，阳性记3分，强阳性记4分[2]。

2 结 果

2.1各组受试者胎盘组织中PLGF检测结果的比较 妊娠期高血压疾病的PLGF评分显著低于正常妊娠组，随病情加重PLGF有下降趋势，重度子痫前期组<轻度子痫前期组<正常妊娠组(P<0.05)；三组受试者胎盘组织中PLGF评分的比例比较差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

2.2各组受试者胎盘组织Flt-1免疫组化染色评分的比较 Flt-1蛋白在妊娠期高血压疾病胎盘中的评分随病情加重呈下降趋势(P<0.05)，重度子痫前期组<轻度子痫前期组<正常妊娠组；三组受试者胎盘组织中Flt-1免疫组织化学染色评分的比例比较差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

2.3各组受试者胎盘组织Flt-1表达定量分析的结果比较 病理彩色图像分析仪对Flt-1蛋白的表达进行平均灰度图像分析结果显示：不同程度的妊娠期高血压疾病组与正常妊娠组相比平均灰度随病情加重有降低趋势，重度子痫前期组<轻度子痫前期组<正常妊娠组(P<0.05)(表3)。

表1 各组受试者胎盘组织PLGF检测结果的比较

PLGF：血管内皮生长因子1；a：与正常妊娠组比较,q=5.17,5.63，P<0.05；b：与子痫前期轻度组比较，q=6.11，P<0.05

表2 各组受试者胎盘组织Flt-1免疫组织化学染色结果的比较

PLGF：血管内皮生长因子1；a：与正常妊娠组比较,q=14.13,14.47，P<0.05；b：与子痫前期轻度组比较，q=10.46，P<0.05

表3 各组受试者胎盘组织Flt-1表达定量分析

PLGF：血管内皮生长因子1；a：与正常妊娠组比较,q=3.17,3.35，P<0.05；b：与子痫前期轻度组比较，q=4.27，P<0.05

3 讨 论

妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病，是威胁母婴健康最常见的一种疾病，发病率可高达10%左右，是目前导致我国孕产妇死亡的第二位死因[3]。

妊娠期高血压疾病的发病机制尚不明确，但胎盘缺血缺氧血管内皮损伤学说被广泛接受[4]。PLGF是血管内皮生长因子的一种，有不同蛋白质亚型[5]，其作用包括促使血管内皮细胞的增生、迁徙和激活，促使血管生成和形成[6]。研究表明，血管内皮细胞损伤和胎盘浅着床是妊娠期高血压疾病发病的中心环节[7]，甚至有学者将妊娠期高血压疾病视为血管内皮损伤性疾病[8]。

本研究结果显示,妊娠期高血压疾病各组患者胎盘组织PLGF评分显著低于正常妊娠孕妇，并随着病情加重有逐渐下降趋势，推测妊娠期高血压疾病患者可能由于胎盘缺血缺氧，使滋养细胞形态和功能发生改变，并引起PLGF分泌下调，而较低的PLGF 水平又影响妊娠期高血压疾病患者绒毛外滋养细胞增殖和浸润能力，使血管生成和形成受阻，导致胎盘血管重构障碍，使胎盘缺血缺氧进一步发展。

本试验对胎盘组织Flt-1定位研究结果显示：Flt-1蛋白是血管内皮生长因子高亲和性受体之一，广泛存在于血管内皮细胞和滋养细胞等[9]。Flt-1在胎盘绒毛主要表达于滋养细胞和血管内皮细胞，间质细胞散在表达，表达部位在胞膜、胞质[10]。胎盘免疫组织化学分析结果显示，妊娠期高血压疾病胎盘组织中Flt-1评分显著低于正常妊娠孕妇，并随病情的加重有降低的趋势，推测Flt-1降低，影响了滋养叶细胞的分化与增殖，其分化异常使细胞与细胞、间质的反应减弱，限制了滋养叶细胞的侵润能力，造成滋养叶细胞侵入缺陷，使胎盘浅着床，胎盘绒毛缺血、缺氧，而下调的Flt-1和PLGF与血管内皮生长因子结合力下降，使血管内皮的完整性受损，影响胎盘血管的形成，造成胎盘血流减少，进一步损伤了血管内皮细胞的功能，从而产生小动脉痉挛等一系列典型妊娠期高血压疾病的病理变化。

综上所述，PLGF、Flt-1在妊娠期高血压疾病发病机制中起重要作用，若能动态观察PLGF、Flt-1的变化，有可能对妊娠期高血压疾病的治疗起重要指导作用。

[1] 赵云，邹丽，李剑，等.妊娠期高血压疾病母体血清及胎盘组织中HCG的表达[J].中国妇幼保健，2008,23(2)：252-254.

[2] 段莉.护理干预对妊娠高血压综合征患者的影响[J].基层医学论坛,2010,14(3):199-200.

[3] 孙惠玲.妊娠期高血压综合征患者的临床护理[J].中国当代医药,2009,16(22):127-128.

[4] 林其德.妊娠高血压综合征病因学研究进展与展望[J].中华妇产科杂志,2003,38(8):471-473.

[5] 王明松，邹良健.血管内皮细胞生长因子家族的研究现状[J].医学综述，2006,12(9)：534-536.

[6] Zeeman GG,Dekker GA,van Geijn HP,etal.Endothelial function in normal and pre-eclamptic pregnancy:a hypothesis[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,1992,43(2):113-122.

[7] 李东志，林其德，林建华.胎盘绒毛缺氧与血管内皮细胞损伤关系的实验研究[J].中国病理生理杂志，2004,20(3)：411,416.

[8] 徐平，韦慈，姜邦荣,等.妊娠高血压综合征患者血管内皮生长因子、胎盘生长因子变化的研究[J].中国现代医学杂志，2003,13(8):12-14.

[9] Hiratsuka S,Maru Y,Okada A,etal.Involvement of Flt-1 tyrosine kinase(vascular endothelial growth factor receptor-1) in pathological angiogenesis[J].Cancer Res,2001,61(3):1207-1213.

[10] Tsatsaris V,Goffin F,Munaut C,etal.Overexpression of the soluble vascular endothelial growth factor receptor in preecl-amptic patients pathophysioligical consequences[J].Clin Endocrinol Metab,2009,88(11):5555-5563.