核桃愈伤组织诱导及分化培养研究进展

蔡小东，曹文娟 （长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025）

核桃 （Juglans）为落叶乔木，是经济价值、营养价值和药用价值都较高的坚果和木本油料树种，也是常见的园林绿化树种之一。然而，常规繁殖技术制约了核桃良种的推广。核桃实生繁殖童期较长且因天然杂交易产生变异，叶片或枝条扦插繁殖存在生根困难的问题，嫁接繁殖又因核桃内含较多的酚类物质，嫁接成活率往往很低［1］。植物离体培养技术为核桃良种快速繁殖和生物技术育种提供了一条新途径，尽管核桃属植物是公认的较难离体培养的植物之一，但仍然受到国内外学者的广泛关注［2－10］。笔者综述了外植体基因型、培养基成分 （生长调节物质、基本培养基、凝固剂及培养基添加物）、外植体来源及光照条件对核桃愈伤组织诱导的影响，介绍了核桃愈伤组织悬浮系建立及分化培养的研究现状，并展望了愈伤组织在核桃生物技术中的应用。

1 核桃愈伤组织诱导的影响因素

从理论上讲，几乎所有高等植物的各种器官或组织在适宜的植物生长调节物质及适宜浓度等条件下离体培养，都能产生愈伤组织。然而，愈伤组织的形成是一个复杂过程，受外植体基因型、培养基成分、外植体来源、生长调节物质、凝固剂、培养基添加物及光照条件等诸多因素之间相互作用的影响。

1.1 基因型

基因型对愈伤组织的诱导有决定性的影响。核桃属是木本植物中较难离体培养的树种之一，目前愈伤组织诱导方面的报道仅集中在核桃 （J.regia）和黑核桃 （J.nigra）2个种中。不仅如此，不同品种的核桃在愈伤组织诱导率方面也存在差异。如Farsi等 （2012）发现在同等光照及培养基条件下，‘Chandler’核桃愈伤诱导率均显著低于 ‘Hartley’核桃。

1.2 外植体来源

所有外植体都有诱导愈伤组织成功的潜在可能性。前人研究表明核桃可以从实生苗或组培苗叶片、茎尖、叶柄、叶脉以及成熟或未成熟胚、子叶、胚轴等不同部位诱导出愈伤组织。一般而言，核桃幼胚及其组分愈伤组织诱导率高于叶片叶片、茎尖、叶柄、叶脉。方宏筠等［3］以黑核桃的幼胚和幼叶为外植体，发现幼叶的愈伤组织诱导率 （15.4%）明显低于幼胚 （67.7%）。在一些研究中，核桃体胚发生往往伴随着愈伤组织的出现。汤浩茹［7］以3个德国主栽优良核桃品种不同发育时期的胚珠、胚轴与子叶以及试管苗叶片、叶柄和茎段为试材，研究了核桃的体细胞胚胎发生，发现培养在MS与DKW上的子叶75%以上形成了大量淡黄色愈伤组织。Payghamzadeh等［8］在用植物生长调节剂处理核桃幼胚时，发现除了幼胚萌芽、根和芽的增殖外，还有愈伤组织的形成。植物胚乳培养过程中往往会有愈伤组织的形成，在核桃胚乳离体培养再生三倍体植株的过程中，也有愈伤组织的出现［9］。不同外植体诱导的愈伤组织质量也有很大差异。刘淑兰等［10］研究发现从核桃茎尖、叶柄及叶脉等不同部位均可诱导愈伤组织，但是愈伤组织质地和颜色不同，只有茎尖愈伤组织则表现为松散乳白色，在光下培养不转绿，这种愈伤组织可长期维持分裂能力。不仅如此，外植体取材时间对愈伤组织诱导率及其质量也有较大影响。Neuman等［11］研究发现，黑核桃花后10、12及14周的子叶诱导获得的愈伤组织体积最大，干重也最大。

1.3 培养基

1.3.1 生长调节物质

生长调节物质的种类、含量及组成比例是调控外植体产生愈伤组织的主导因素。Heile－Sudholt等［12］以黑核桃的胚轴和实生苗茎尖为外植体，发现6－BA的浓度对胚根、上胚轴、不定芽及愈伤组织诱导影响很大，6－BA能刺激愈伤组织的形成。Payghamzadeh等［8］认为生长素与细胞分裂素在核桃愈伤组织中有至关重要的作用，其中BAP和IBA的浓度决定了愈伤组织的鲜重，0.01mg／L或0.1mg／L IBA和1.5mg／L BAP的生长调节剂组合有利于从核桃未成熟胚或子叶中诱导愈伤组织，并且再生的是淡黄色或白色的疏松愈伤组织，但是这些愈伤组织生长慢。冀爱青等［13］用正交设计法研究了不同植物生长调节剂处理对核桃子叶胚性愈伤组织诱导的影响，结果表明，植物生长调节剂影响核桃子叶胚性愈伤组织诱导的因素大小为6－BA＞KT＞IBA。不同植物生长调节剂对愈伤组织的质地及颜色也有影响。在含2，4－D的培养基上，Fernández等［14］发现开始出现的愈伤组织呈绿色瘤状，而在添加NAA或IBA的培养基上，由于花色素的存在，愈伤组织则呈红色或粉红色，且在含有2，4－D的培养基上愈伤组织鲜重比在添加NAA或IBA的培养基上的低。

1.3.2 基本培养基

目前国际上流行的植物培养基有几十种。DKW是核桃叶片培养、茎段培养、胚培养及体胚诱导的首选培养基，但也有人认为DKW 并不适于黑核桃的体胚诱导［11，15］。Avilés等［16］研究了BTM、MS、DKW及WPM 4种基本培养基对成年核桃叶片愈伤组织诱导的影响，结果发现在4种培养基上愈伤组织诱导率并没有显著差异，但是在BTM培养基和WPM培养基上瘤状愈伤组织诱导率显著高于其他2种培养基，且在BTW培养基诱导的愈伤组织状态较好。Farsi等［6］发现NN和MS培养基对愈伤组织诱导率及褐化有很大影响，培养第6周，‘Hartley’核桃黑暗或低光强培养在NN培养基上愈伤诱导率最高，‘Chandler’核桃低光照培养在MS培养基上或改良光照条件下培养在NN培养基上愈伤诱导率最低；在MS培养基上，‘Chandler’核桃在黑暗或低光照条件下褐化较严重。

1.3.3 凝固剂及培养基添加物

不同类型凝固剂所含的成分、纯度和物理性能都存在差异，影响培养基的物理结构与培养物对营养成分的吸收利用，从而影响外植体的生长发育。Gelrite透明度较琼脂高，凝固温度低且透气性好，含Ca、Mg杂质也少，Cornu等［17］认为Gelrite促进了核桃愈伤组织的形成。Phytagel也是一种新型的培养基固化剂，具有一定的防褐化作用，能提高胚性愈伤组织增殖速度、体细胞胚胎发生和植株再生频率。在核桃愈伤组织诱导中，通常在培养基中添加2.1～2.5g／L Phytagel来促进愈伤组织的形成［6，16］。

在培养基中添加有机附加物，如甘氨酸、水解酪蛋白、酵母汁、椰汁、土豆汁及马铃薯提取液等，可促进外植体的生长发育。在核桃的离体培养中，也常常通过在培养基中添加一些有机附加物来促进外植体的分化或脱分化，其中甘氨酸和水解酪蛋白是在进行体胚发生或愈伤组织诱导中常用的培养基添加物［5，8，11］。

1.4 培养条件

光照条件也是影响核桃愈伤组织诱导和增殖的重要因素之一。张燕等［18］发现较弱光照下核桃愈伤组织颜色呈现黄绿色、淡黄色等，而在黑暗条件下愈伤组织呈白色，但是褐变现象严重。

当然，核桃愈伤组织的诱导率，愈伤组织的生长量，质地颜色是受上述因素综合影响的。Farsi等［6］以成熟核桃树茎段离体繁殖的叶片为外植体，以添加不同浓度的BA和NAA的MS和NN作为培养基，采用黑暗，低光强及改良光强 （第一月培养在黑暗条件下，随后采用低光强培养）3个光照培养条件，探讨了核桃品种、培养基、光照条件对叶片诱导愈伤组织的影响。结果在3种光强处理下大部分再生的愈伤是疏松的非胚性愈伤组织，但愈伤诱导率与品种、培养基、光照条件及它们间的互作有关。就目前研究现状而言，这些因素在核桃愈伤组织诱导中的互作仍需更深入的研究。

2 愈伤组织悬浮系的建立

优良的愈伤组织悬浮系是开展遗传转化或原生质体操作的基础之一。有关核桃愈伤组织悬浮培养的研究报道很少。袁巧平等［2］用核桃的幼胚作外植体，在子叶部位形成胚性愈伤组织，在液体培养基中进行振荡培养，发现胚性愈伤组织在悬浮振荡培养中可保持分生能力。Rodríguez等［19］以核桃成熟胚为外植体，获得了愈伤组织并初步建立了愈伤组织悬浮系。然而，有关这些悬浮系的利用并没有后续报道。

3 分化培养

愈伤组织可以通过胚状体途径或器官发生途径再生植株。然而，从核桃不同部位诱导的愈伤组织很容易褐化死亡，很难长期保存，愈伤组织分化培养也较困难［5］。但也有一些愈伤组织再生根、芽甚至胚状体的报道。汤浩茹［7］研究发现核桃愈伤组织在诱导培养基上培养能再生根，但未诱导出芽。张燕等［18］从核桃叶片诱导出愈伤组织的经不同激素组合诱导，再生了芽。方宏筠等［3］发现黑核桃胚性愈伤组织转入胚状体诱导培养基后，部分胚性愈伤组织生长受到抑制并逐渐萎缩死亡，但有些胚性愈伤组织能够分化发育产生胚状体。Fernández等［14］将NAA或IBA诱导的愈伤组织在含有NAA或IBA的液体培养基中进行悬浮培养，发现这些细胞系具有体胚发生能力。然而，目前还没有核桃愈伤组织最终分化成苗的报道。

4 展望

我国核桃资源丰富，分布范围广，遗传类型多样。现代生物技术的发展为核桃育种提供了新的方法，有望克服常规育种中遇到的各种问题。愈伤组织是种质资源保存、细胞培养、原生质体相关操作以及遗传转化等研究的理想起始材料。诱导核桃胚性愈伤组织特别是胚性愈伤组织是开展核桃生物技术及相关研究的基础［20］，研究核桃愈伤组织的诱导、增殖及分化培养有重要的理论和实践意义。目前，核桃愈伤组织培养还没有形成完整的体系。因此，核桃愈伤组织的诱导、增殖、悬浮系建立、分化培养需要更深入的研究。

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