玛咖提取物对小鼠运动性疲劳的作用研究

陈 成， 邱明鸿， 马云淑△， 陈 茹， 马恒娇， 黄婷婷(.云南中医学院， 云南 昆明 650500； .昆明元正生物科技有限公司， 云南 昆明 650500)

疲劳是指由机体运动本身所引起的“机体生理过程不能续持其功能在特定水平和或不能维持预定的运动强度”的机体运动能力下降的现象[1]。主观上出现疲乏无力等不适感，并导致工作效率的降低。随着生活节奏的加快、工作压力的增大，疲劳越来越成为影响人们生活质量的重要因素。因此，延缓疲劳的发生和促进疲劳的恢复一直是医学界研究的热点。

玛咖(LePidiummeyenii，Maca)为十字花科(Cruciferae)独行菜属(LePidium)一年生草本植物[2]，原产于海拔3500～4500 m的南美安第斯山区，丽江和会泽两地因地理环境与原产地相似，种植已获得成功。玛咖形似萝卜的根茎，传统上作为食物和草药，用于增强体力、提高精力、调节免疫、改善性功能等[3-8]。现代研究表明，玛咖含有玛咖生物碱、芥子油苷和异硫氰酸酯、甾醇及其衍生物和硫氢酸苄及氨基酸类、多糖类、无机元素等多种化学成分[9]。目前对玛咖的研究与保健品开发方兴未艾，国内市场上大部分保健食品多采用玛咖生粉作为原料，生粉有效成分含量有限，有必要对其去粗取精，减少服用量，增强其保健功能，这也是玛咖类保健食品开发的关键问题之一，本实验采用丽江引种玛咖为原料，在经研究确定玛咖醇水双提取工艺的基础上，以玛咖生粉为对照，考察了玛咖提取物对小鼠运动性疲劳的影响，为进一步开发利用丽江玛咖打下基础。

1 仪器与材料

1.1 实验动物 昆明种小鼠，SPF级，体重(20±2)g，生产许可证：SCXK(川)2008-24，批号：0016699。适应性饲养1周后进行实验。动物实验于云南中医学院完成。

1.2 仪器 ZDHW调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)；R 10023旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；L-550台式低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；DFY-800摇摆式高速中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；Sartorius BT 25s电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；DY 89-II型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；80-2台式低速离心机(山海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂)；WFZ UV-2000型紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)；秒表；温度计；灌胃针头，手术器械。

爬杆器具：自制，直径1 cm，长25 cm的玻璃棒，砂纸(120目)打磨后上端固定在木板上制成爬杆架，下端悬空，玻璃棒下端距离地面30 cm，地面铺上2 cm左右的海绵以防止小鼠落下摔伤。

游泳箱：根据《保健食品检验程序和方法》要求自制，规格：505040 cm。

1.3 试药 玛咖(LePidiummeyenii，Maca，丽江)与玛咖提取物(均由由昆明元正生物科技有限公司提供)；D-无水葡萄糖标准品(中国药品生物制品检定所)；蒽酮(AR，天津大茂化学试剂厂，批号：20130725)；硫脲(AR，中国成都金山化工试剂厂四川，批号：20130605)；三氯乙酸(AR，上海山浦化工有限公司，批号：20130730)；浓硫酸(AR，云南扬林工业开发区汕镇药业有限公司，批号：20121221)；生理盐水(昆明市宇斯药业有限责任公司，批号：13022201)；无水乙醇(AR，天津大茂化学试剂厂，批号：20130529)；铅皮(购自渔具店)；5%的三氯乙酸配制：精确称取5.0 g三氯乙酸，用蒸馏水溶解，定容到100 mL的容量瓶中，即可；葡萄糖标准溶液配制：使用前先将葡萄糖标准品至于五氧化二磷减压干燥器中干燥12 h，准确称取100.00 mg，用蒸馏水溶解，定容至100 mL，制成葡萄糖标准储备液；蒽酮试剂中含 0.05% 蒽酮，1% 硫脲，用72% 硫酸配制；蒽酮试剂的配制参照文献[10]。

1.4 玛咖提取物(醇水双提物)的制备 玛咖干燥药材饮片，将其粉碎成粗粉，称取粗粉1 kg，加10倍量80%的乙醇回流提取2 h，冷却，过滤；残渣再加入8倍量80%的乙醇回流提取1.5 h，冷却，过滤，滤液与第1次滤液合并，于旋转蒸发仪上低温(60℃)回收乙醇，蒸发至干，得醇提物浸膏；残渣再加入10倍量的水提取2 h，用纱布滤过，滤液经3000 r/min离心15 min，上清液蒸发至干，得水提取浸膏。此法制得醇提物浸膏266.4 g，水提物浸膏70.4 g，将浸膏粉碎混合均匀，得总浸膏336.0 g，即1 g总浸膏相当于2.98 g(约3 g)生药。

2 方法

2.1 动物分组与给药 将昆明种小鼠适应性饲养一周，对其爬杆能力进行初筛后分为5组，即空白对照组、玛咖提取物高、中、低剂量组和玛咖生药粉组。连续灌胃给药，提取物高、中、低剂量组分别给予提取物3 g·kg-1·d-1(相当于生药9 g·kg-1·d-1)、2 g·kg-1·d-1(相当于生药6 g·kg-1·d-1)和1 g·kg-1·d-1(相当于生药3 g·kg-1·d-1)，原药粉组给予生药粉末(过200目筛)3 g·kg-1·d-1，空白组给与等体积的生理盐水。实验各组小鼠均自由摄食与饮水。

2.2 小鼠爬杆实验 对小鼠进行爬杆能力初筛后，弃去不爬杆的小鼠，筛选出爬杆时间相近的小鼠随机分配到空白组、玛咖提取物高、中、低组和原药粉组，每组10只。给药剂量按方法2.1进行，连续灌胃15 d。末次灌胃给药30 min后开始实验。将小鼠放到玻璃棒上，使肌肉处于静力紧张状态，记录小鼠由于肌肉疲劳从玻璃棒上跌落下来的时间，第3次跌落时终止实验，累计3次的时间作为爬杆时间。

2.3 小鼠力竭游泳实验

2.3.1 小鼠游泳能力初筛 实验前预先对所有正常小鼠进行力竭游泳筛选，尾根部负荷5%体重的铅皮，水深30 cm，水温(25±0.5)℃，记录小鼠自落水开始至鼻孔沉入水面下5 s不浮出水面的时间作为小鼠游泳时间，筛选出游泳时间相近的小鼠随机分配到空白组、玛咖提取物高、中、低剂量组和原药粉组，每组10只，给药方式同方法2.1。

2.3.2 小鼠力竭游泳时间测定 各组小鼠喂饲到第15天，灌胃给药30 min后，置于水温(25.0±0.5)℃，水深30 cm的游泳箱中5%力竭游泳。为了防止互相挤靠，影响实验结果，每次放入小鼠5只，在实验过程中使每只小鼠四肢保持运动，如果小鼠漂浮在水面四肢不动，用玻璃棒在其附近搅动，促进其运动。以小鼠沉入水底，10 s不能浮出水面为溺死指标，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间。

2.4 小鼠运动后肝糖原的测定实验

2.4.1 葡萄糖吸光度标准曲线的绘制 取6支干净的试管，分别吸取葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL于各试管中，再分别向各试管中加入1.9、1.8、1.7、1.6、1.5和1.4 mL蒸馏水，使各试管中液体的体积都等于2 mL，然后和实验组试管进行同样的操作，测其吸光度，绘制标准曲线。测得的吸光度分别为0.157、0.320、0.463、0.608、0.739和0.894。标准曲线方程为y = 1.4534x + 0.0215，R2= 0.9992。

2.4.2 实验与肝糖原测定方法 将小鼠适应性饲养一周后，按体重将其随机分成5组：空白组、玛咖提取物高、中、低剂量组和原药粉组，每组10只。按照方法2.1给药，连续给药15天，于末次给药后30 min，在温度30℃的水箱中不力竭游泳90 min(每箱一次放入5只)，每次入水前均将水温调至30 ℃，室温恒定在 25 ℃。 游泳后立即处死取肝。参照文献[10]测定肝糖原的含量。

3 结果

3.1 玛咖提取物对小鼠爬杆时间的影响 实验结果表明，玛咖提取物低剂量组与空白对照组和玛咖生药粉组相比较，均能显著延长小鼠的爬杆时间(P<0.01)，说明低剂量的玛咖提取物具有明显的抗运动性疲劳的作用；而中剂量、高剂量和原药粉组与空白组比较，差异无显著性意义(P>0.05)。见表1。

表1 玛咖提取物对小鼠爬杆时间的影响

3.2 玛咖提取物对小鼠力竭游泳时间的影响 游泳试验结果显示，玛咖提取物低剂量组能显著延长小鼠力竭游泳时间(P<0.01)，而玛咖生药粉组与空白组比较，差异无显著性意义。说明低剂量玛咖提取物与玛咖生药粉相比，具有更好的抗疲劳作用。见表2。

表2 玛咖提取物对小鼠力竭游泳时间的影响

3.3 玛咖提取物对小鼠持续运动后肝糖原含量的影响 结果见表3。

表3 玛咖提取物对小鼠持续运动后肝糖原含量的影响

4 讨论

实验结果显示，灌胃玛咖提取物低剂量组的小鼠爬杆时间显著地高于生理盐水组(P<0.01)，在力竭游泳试验中持续游泳时间也较生理盐水组显著增长(P<0.01)，持续运动后肝糖原积累含量显著高于生理盐水组(P<0.05)。提示长期服用适当课题中的玛咖提取物可提高小鼠的运动耐力，延长小鼠的持续运动时间，具有一定的缓解体力疲劳作用。并且玛咖提取物低剂量组与玛咖生药粉组相比较，也能显著延长小鼠的爬杆时间(P<0.01)和力竭游泳时间(P<0.05)，说明，对丽江引种玛咖按实验方法提取后，具有去粗取精、增加其抗运动性疲劳的作用。

本实验研究还发现，将实验各组小鼠(每组10只，共50只)继续饲养到30天后，玛咖生药粉组小鼠体重(27.72±2.29)g和玛咖提取物低剂量组小鼠体重(27.10±1.15)g显著低于空白对照组(31.31±1.52)g(P<0.01)，而玛咖提取物中剂量组小鼠体重(30.62±2.80)g和高剂量组的小鼠体重(32.91±3.17)g与空白对照组比较，三组之间的体重差异无显著性意义。提示连续服用适量的玛咖或者玛咖提取物，有控制小鼠的体重的作用。也提示中、高剂量的玛咖提取物抗疲劳作用不明显，可能与小鼠体重增长、运动不协调有关。

机体产生疲劳的机制较为复杂[11]，主要包括能源物质耗竭、疲劳物蓄积、自由基增多、中枢神经系统工作能力下降、机体内环境失调等。运动性疲劳可分为躯体性疲劳和心理性疲劳[12]。躯体性疲劳主要表现为运动能力下降，心理性疲劳主要表现为行为的改变。疲劳的评价方法主要有运动耐力实验和生化改变的检测。运动耐力是反映机体疲劳最直接、最客观的指标。所谓抗疲劳，就是延缓疲劳的产生和/或加速疲劳的消除。运动耐力的测定方法有运动跑台、爬杆和游泳。运动跑台有滚筒式和平板式两种，该装置较贵，不便于推广[10]。爬杆装置简单，但有的小鼠并非因疲劳落地，而是由于其他主观原因而放弃抓杆掉落下来的，并且因小鼠趾甲的抓损和杆的光洁度等因素很难保持一致，因此爬杆实验结果个别组的标准偏差过大，不如游泳试验结果可靠。但爬杆实验侧重于考察小鼠肌肉对静态力的持久能力[13]。游泳试验装置简单，且实验结果能客观地反映机体的体能，最为常用。

为了系统的评价玛咖提取物的抗疲劳作用，实验测定了小鼠运动后肝糖原的含量，体内的糖水平与运动时的耐力密切相关，增加肝糖原含量可以增强机体的抗疲劳能力，肝糖原含量是一个较敏感的指标。实验发现，玛咖提取物可促进肝糖原的积累，提示玛咖提取物可有效改善机体对运动负荷的压力。

5 小结

实验中以低剂量的玛咖提取物所表现的抗疲劳作用最好，过高剂量反而无明显抗疲劳作用，提示服用适当剂量的玛咖提取物会有良好的抗疲劳作用。因此，为了弄清玛咖提取物抗疲劳作用的机理，还需要进行深入的相关实验研究。

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