盐胁迫下盐角草Na+/H+转运基因表达分析

吴晓朦， 马雪梅， 马金彪， 姚银安

(1．中国科学院 新疆生态与地理研究所 干旱区生物地理与生物资源重点实验室， 新疆 乌鲁木齐 830011；2．中国科学院大学， 北京 100049)

土壤盐渍化是一个限制全球农业生产的重要原因，在高盐胁迫下会导致植物细胞膜透性增加、细胞内Na+/K+离子比例失衡等，进而对其生存造成毒害[1]。植物一般通过如下途径抵御盐胁迫：增加Na+外排、Na+区隔化到液泡内和根系对Na+的限制吸收[2]。

Na+/H+逆向转运蛋白NHA负责将Na+从细胞质排至胞外[3]。NHA基因家族在细菌中的研究较多，目前已发现NhaA[4]，NhaB[5]，NhaC[6]，NhaD[7-8]，NhaG[9]，NhaP[10]和NhaK[11]。在高等植物中对其研究甚少，只有NhaD转运蛋白曾在胡杨(PeNhaD1)[12]、小立碗藓(PpNhaD1)[13]和冰叶日中花(McNhaD)[14]中被发现并进行功能验证。植物中的NhaD蛋白序列与细菌中的十分相近，具有协调Na+浓度和Li+/H+逆向转运功能[15]。

位于液泡膜上的NHX基因家族通过将细胞质中的Na+区隔化到液泡中、维持K+的动态平衡[16]及调节pH值等作用保护植物不受盐损伤，并通过囊泡运输和细胞扩增等方式调节植物正常生长[17]。NHX基因家族分为两个亚家族(Class I和Class II)：Class I中的成员(NHX1～4)定位在液泡膜上，负责将细胞质中的Na+区隔化到液泡中，更多地研究表明AtNHX1和AtNHX3还具有转运K+的能力[18-19]；Class II的成员(NHX5～6)定位在液泡膜附近的高尔基体或小泡上，参与介导囊泡的运输[20]。

盐角草(Salicorniaeuropaea)分布于中国新疆、江苏、浙江等地，是一种典型的耐盐植物，已经成为研究植物耐盐机理的模式植物[21]。Na+/H+逆向转运蛋白NHX和NhaD对于盐生植物的正常生长具有重要作用：除提高抗盐性外，还能够降低地上部水势，促进水分吸收，调节气孔开闭。因此，本研究基于盐角草转录组测序组装结果，筛选出Na+/H+转运相关的RNA序列，通过与NCBI数据库比对分析得到4条NHX全长序列及1条NHA序列；为了解盐分条件是如何调控这些基因的表达从而满足盐角草正常的生理功能，本研究设置了两种盐分转化条件：1)盐角草在无盐条件下培养后进行盐分处理，确定上述基因的表达变化；2)盐角草在200 mM 的NaCl水平下正常生长，去除培养环境中盐分后上述基因的表达变化。本研究可为盐生植物Na+/H+转运蛋白家族的功能分析提供重要基础。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

盐角草种子采自新疆阜康市五零零水库周边盐碱地，采集后烘干备用。RNA提取试剂盒(QIAGEN 74904)购自QIAGEN公司，反转录试剂盒(TaKaRa RR037A)、荧光定量试剂(TaKaRa RR081A)购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 Na+/H+转运蛋白基因全长的电子克隆及进化树构建对盐角草RNA-Seq的组装结果进行注释[22]，找出注释与Na+/H+转运蛋白相关的Unigene。用电子克隆的方法获取全长cDNA序列[23]：从NCBI网站上下载已有的盐角草核苷酸参考序列；用Cap3软件对本地盐角草序列与下载的参考序列进行序列拼接；运行本地Blast程序挑选出组装结果中与本地盐角草Na+/H+转运蛋白Unigene有互补区域的Contig；在NCBI的ORF finder网站上对筛选出的序列进行开放阅读框预测，获得全长cDNA及对应的蛋白质序列。

下载其他相近物种(如拟南芥、水稻、胡杨、玉米等)的NHX基因家族及NhaD蛋白质序列，利用ClustalX2对预测蛋白质序列和参考蛋白质序列做多序列比对[24]，用MEGA软件进行系统进化分析[25]。

1.2.2 材料的处理材料处理主要包括两类：盐角草在无盐条件下培养后进行盐分处理；以及盐角草正常生长于一定浓度含盐基质后，进行培养基质盐分去除处理。对于第一类处理，此前的研究发现：普通沙培基质均含有微量或者少量盐分，且很难消除砂培基质中的盐分影响，这样导致盐角草植株中往往含有相当浓度的盐分。因此我们分别设置砂培和琼脂培养两种条件进行无盐条件下的植株培养，从而比较两种条件培养的植株在盐分处理下的基因表达差异。张梅茹[26]、Lv[27]等研究发现，在一定浓度NaCl溶液处理下会促进盐角草的生长，其最适生长浓度在200 mM左右；当NaCl浓度超过最适生长浓度后，抑制盐角草生长。因此本研究选取200 mM NaCl溶液作为处理试剂，在保证盐角草正常生长的前提下分析Na+/H+转运基因对盐胁迫的响应情况。

我们设置如下3种处理：

第1类处理：盐角草在无盐条件下培养后进行盐分处理。

LH(低-高)处理：盐角草种子经4周沙培发育成幼苗(砂培的营养液中不含Na+)；将幼苗从沙培环境移栽到不含盐分的液体培养体系中进行培养10 d，然后更换含有200 mM的NaCl营养液(培养液其他成分与前面相同)培养，培养8 d。从更换培养基前(第0天，d0)及更换后的第1、2、3、7 天每天取一份盐角草的根和茎样品。

LHM(低-高-MS培养基)处理：盐角草种子在1/2 MS培养基中经54 d发育成幼苗(培养基中不含Na+)；更换含有200 mM NaCl的1/2 MS培养基继续培养8 d，从更换培养基前(第0天，d0)及更换后的第1、2、3、7 天每天取一份盐角草的根和茎样品。

第2类处理：含盐基质中生长的盐角草的盐分去除培养

HL(高-低)处理：盐角草种子经4周沙培发育成幼苗(砂培的营养液中不含Na+)；将幼苗从沙培环境移栽到含有200 mM的液体培养体系中进行培养10 d；然后更换不含Na+的营养液培养，培养8 d。从更换培养基前(第0 d，d0)及更换后的第1、2、3、7天每天取一份盐角草的根和茎样品。

所有样品采集后立即用液氮速冻防止mRNA降解，在-80℃冰箱长期保存。样品用于荧光定量PCR(qPCR)检测上述5个基因的表达量变化情况。

1.2.3盐角草总RNA的提取和cDNA的合成用QIAGEN公司RNA提取试剂盒分别提取不同处理方法、不同组织的盐角草样品总RNA；经琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000微量分光光度计检测，确保RNA质量合格，并记录RNA浓度。

按照Takara反转录试剂盒说明书，不同样品以相同的RNA上样量反转录成cDNA，浓度稀释10倍备用。

荧光定量PCR引物设计：以alphatubulin基因作为内参基因，按照标准荧光定量PCR引物设计原则，用Primer Premier 5软件，设计PCR引物序列。alpha tubulin基因上游引物为5′-AGGTCAACAAAGACAGCA-3′，下游引物为5′-AGCGAAAATGAGAGAGTG-3′，产物长度为215 bp。

根据盐角草RNA-Seq组装注释结果，合成盐角草Na+/H+转运蛋白基因的引物，引物序列见表1。

表1 盐角草Na+/H+转运蛋白基因荧光定量PCR引物序列及产物长度Table 1 Primer pairs and products’ length of Salicornia Na+/H+ antiporters

1.2.4 荧光定量PCR检测荧光定量PCR反应体系为20 μL：SYBR PremixExTaqTM(2×) 10 μL，超纯水6.4 μL，上下游引物(10 nmol/l)各0.8 μL，cDNA模板2 μL。反应程序为：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s， 40个循环；溶解曲线：由65℃增温至95℃，每5 s增加0.5℃。每个PCR反应重复3次。反应结束后记录Ct值。qPCR值提高1倍或者降低50%以上，认为其表达量发生变化。

2 结果与分析

2.1 从RNA-Seq结果中筛选Na+/H+转运蛋白基因

从NCBI网站上搜索到已有盐角草核苷酸序列654条、EST序列1439条，经电子克隆分析后，获得5条完整的盐角草Na+/H+转运蛋白对应cDNA序列，将其命名为SeNHX1、SeNHX3、SeNHX4、SeNHX5和SeNhaD。构建的N-J进化树如图1所示。

由图1可知NHX基因家族分为3部分，NHX1～NHX4(Class I)、NHX5～NHX6(Class II)和SOS。SeNHX1、SeNHX3和SeNHX4分布在Class I中，SeNHX5分布在Class II中，SeNhaD与植物的NhaD蛋白序列能够较好地聚类。

图1 盐角草与其他植物Na+/H+转运蛋白系统进化树分析Fig 1 Phylogenetic analysis of Na+/H+ antiporters of Salicornia europaea and other plants

At:Arabidopsisthaliana[28], Le:Solanumlycopersicum[29], Mc:Mesembryanthemumcrystallinum[14], Ol:Ostreococcuslucimarinus[30], Os:Oryzasativa[31], Pe:Populuseuphratica[12, 32], Pp:Physcomitrellapatenssubsp.patens[13], Se:Salicorniaeuropaea, Ta:Triticumaestivum[33], Zm:Zeamay[34]

2.2 荧光定量PCR结果

一次荧光定量PCR中检测LH/LHM或HL处理下所有样品的某个基因表达量，以alphatubulin作为内参基因。故每次反应会有两种扩增产物，反应结果如图2所示。从图2-B和2-C中可以看出 ，只有内参基因和检测基因的目的片段被扩增，没有非特异扩增或引物二聚体的生成。

图2荧光定量反应扩增信号及溶解曲线(A—扩增曲线; B、C—溶解曲线)
Fig 2 Detection plot and Dissociation curve of RT-PCR

2.2.1 LH地下部各基因表达量变化因为LHM处理的植物地下部无法采样，故只有LH地下部的分析结果，见图3。在升高盐浓度处理后的几天，根系中SeNHX3(图3B)和SeNHX5(图3D)的应激反应明显，其表达量呈震荡状，均在第1、3天显著提高。SeNHX1、SeNHX4和SeNhaD表达趋势都是在处理后第2、第3天大幅度提高，随后降低。

图3 LH处理样品地下部中Na+/H+转运蛋白基因在不同时间点相对表达量的变化Fig 3 Relative expression (%) of Na+/H+ antiporters in LH root sample of multiple time points in relation to alpha tubulin

A—SeNHX1; B—SeNHX3; C—SeNHX4; D—SeNHX5; E—SeNhaD; d0—the treatment day; d1—the day after treatment; and so on

2.2.2 LH、LHM地上部各基因表达量变化LH和LHM处理下样品地上部各基因相对表达量统计结果见图4。LHM处理下SeNHX1(图4A)和SeNHX5(图4D)在第3 d表达量显著增高，随后回落至之前的表达水平；而LH处理下这两个基因分别在第3 d和第2 d表达量显著加强后回落。SeNHX3(图4B)基因在LH处理下处理1 d即大幅度提高，随后降低，而LHM处理2 d后表达量显著下降。SeNHX4(图4C)在LH处理下表达量高于LHM处理，盐分处理1 d后均显著升高，随后降低。SeNhaD(图4E)在LH处理后的第2天有大幅增高，但在LHM处理中没有受到影响。

SeNHX1、SeNHX3和SeNHX5在两种处理下表达基数都比较高，总的来看LHM处理的表达变化比LH更明显。

图4 LH处理样品地上部中Na+/H+转运蛋白基因在不同时间点相对表达量的变化Fig 4 Relative expression (%) of Na+/H+ antiporters in LH shoot sample of multiple time points in relation to alpha tubulin

A—SeNHX1; B—SeNHX3; C—SeNHX4; D—SeNHX5; E—SeNhaD

图5 HL处理样品地下部中Na+/H+转运蛋白基因在不同时间点相对表达量的变化Fig 5 Relative expression (%) of Na+/H+ antiporters in HL root sample of multiple time points in relation to alpha tubulin

A—SeNHX1; B—SeNHX3; C—SeNHX4; D—SeNHX5; E—SeNhaD

2.2.3 HL地下部各基因表达量变化由图5中可以看出在HL地下部中，SeNHX1(图5A)、SeNHX3(图5B)、SeNHX5(图5D)具有相同的表达趋势，在处理后第1 d表达量大幅度降低并随后基本保持稳定。而NhaD(图5E)在处理第1天下降后又提高了其表达量。SeNHX4(图5C)在处理前几乎不表达，处理后的前3天其表达量升高后回落至低表达状态。

2.2.4 HL地上部各基因表达量变化各基因相对于alphatubulin的表达量数据统计结果见图6。SeNHX1(图6A)的表达水平在刚降低盐浓度处理后的第1天，其表达量有明显的增高变化，随后降低至处理当天的水平并基本保持稳定。而SeNHX5(图6D)在盐分去除后2 d表达量显著降低。相反，SeNHX3(图6B)在处理后表达量在第7天显著上升；而SeNHX4(图6C)的表达基数较低，仅在第2天显著降低后很快恢复。SeNhaD(图6E)在处理后3 d降低了表达量，随后提高。通过Barrero-Gil J等人的表达定位实验[13]表明，在小立碗藓中PpNhaD逆向转运蛋白位于叶绿体中。叶绿体位于地上部的叶片中，培养基中盐浓度的变化要经过维管束向上传递，所以SeNhaD表达量在地上部中比2.2.3中地下部要变化迟缓。

图6 HL处理样品地上部中Na+/H+转运蛋白基因在不同时间点相对表达量的变化Fig 6 Relative expression (%) of Na+/H+ antiporters in HL shoot sample of multiple time points in relation to alpha tubulin

A—SeNHX1; B—SeNHX3; C—SeNHX4; D—SeNHX5; E—SeNhaD

3 讨论

参与细胞内离子平衡调节的基因有NHA和NHX基因家族：NHA负责将细胞质内的Na+排出胞外，以降低细胞内的渗透压；NHX基因家族可将细胞质中的Na+区隔化到液泡中，对维持细胞内pH值的稳定和Na+、K+平衡起到十分重要的作用[35-36]。

对于盐角草NHX基因家族和NhaD基因的表达量我们可以看到，在植株的根、茎中只在处理后很少的时间点中升高或者降低，并很快恢复到处理前常态水平。此前的研究也表明植物响应盐分调控仅在处理的前几天发生变化然后恢复常态，而差异蛋白质在盐分处理初期和中后期均有较大的变化[37]。说明提高或者降低基因表达使功能蛋白升高或者降低到一定程度后，基因表达就会恢复到处理前状态，从而保持了其精确调控的特性。

NHX1和NHX2的功能是将Na+区隔到液泡中，影响植物的生长和发育，这两个蛋白还对控制植物细胞的扩增、雄性生殖器官的生长和开花都是不可缺少的[28]。本实验中SeNHX1在盐角草地上部和地下部中都有较高水平的表达，当升高盐浓度处理时其根茎的表达量均在2～3 d盐分处理后达到表达量最高点。类似的，在Anupama等人的研究结果中也报道过海蓬子(Salicorniabrachiate)中SbNHX1在盐处理后48 h其表达量最高[39]；而在去除盐分处理中，我们发现SeNHX1根系表达量也大幅度下调；表明该基因的表达受到盐分浓度的影响。此外，SeNHX1地上部表达量在去除盐分处理后的第1天有大幅度提高，可能是因为地上部感受到微管束盐离子含量的降低，为维持其正常生长，提高NHX1基因表达有助于吸收和争夺维管束盐分。

NHX3和NHX4参与液泡中Na+的吸收，并且NHX3与K+转运有密切关系[19]，Cosentino等[14, 28]和Liu等[19]的结果表明NHX3在地上部和地下部中表达量都很低；然而在盐生植物中NHX3可能发挥着重要作用，盐生植物液泡要主动吸收并维持较高的盐分含量以降低胞内水势从而维持水分吸收功能。因此我们看到盐角草中SeNHX3的表达量较高，其表达水平和对盐分的响应特点也与SeNHX1接近；NHX4的表达情况与其他物种相同，表达量很低，在地下部中几乎检测不到。

与液泡内表达的NHX家族成员1～4不同，Bassil等人[40]发现NHX5和NHX6定位于细胞内的高尔基体和反面高尔基体分子标志(trans-Golgi network markers)上。通过基因敲除实验证实NHX5和NHX6介导囊泡运输[40]，并对维持植物细胞内pH值稳定、离子平衡和细胞应激反应发挥重要作用。我们的实验结果发现，SeNHX5的表达量与基质中盐分含量相关：增高盐浓度时，其表达增加；去除基质盐分其表达降低。表明SeNHX5的表达量与盐角草盐胁迫有相关性。

NHA在星星草(P.tenuiflora)的地下部受NaCl诱导表达显著，而在水稻中则主要在地上部经诱导表达[3]，冰叶日中花的McNhaD基因在地上部的表达量远大于其在地下部的表达[14]。在我们的实验结果中，NhaD在地上部的表达量是地下部的2倍左右，这个结果与水稻和冰叶日中花的趋势相同。并且NhaD在地上部的表达变化时间点较地下部中迟1～2 d。在小立碗藓中的研究表明，NhaD表达定位于地上部的叶绿体中[13]。盐角草中地上部细胞外盐浓度变化小于根部，使NhaD在地上部表达量变化时间晚于根部。

整体来看，在上述结果中NHX1、NHX3、NHX5的表达量明显高于NHX4和NhaD。当盐处理时，这5个基因在地下部中表达差异更明显。此前在耐盐树种胡杨中发现NHX1、NHX3和NHX6的表达要远高于普通杨树种[32]，我们推测NHX1、NHX3和NHX5对于盐角草的耐盐机制也起到很大的作用。

前人一般将盐分处理实验(LH)的植株培养于沙培基质，由于很难清除沙石本身含有Na+，导致盐分处理前植株体内就含有Na+，这可能对盐生植物盐分吸收转运调控的分析产生较大的系统误差；本研究对沙培和琼脂培养(LHM)植株分别进行了盐分处理，以比较Na+/H+转运蛋白对盐分的不同响应。后者植株生长于琼脂培养基，植株在处理前完全不含Na+。我们的研究表明植株含有Na+和不含Na+情况下，盐处理对上述5个基因的表达有较大的差别，多数NHX基因在LHM处理中变化更大，这可能与其感受到更为剧烈的盐分变化有关。而NhaD基因LHM处理下基本不变，原因有待进一步研究。

综上，我们的研究结果表明，NHX基因家族和NhaD的表达量受到基质中盐分含量的调控作用，其表达在盐分处理或者盐分去除1～3 d后发生变化。基因表达受控于植物的精确调节，其基因功能还受到转录后调控、翻译、翻译后调控等影响，因此基于NHX蛋白质表达的研究有助于进一步说明盐生植物NHX基因对盐分的响应特点。

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