尾悬吊大鼠小脑间位核促离子型谷氨酸受体表达增加

宋新爱， 赵雪红, 2， 任俊婵， 樊小力

(1．西安交通大学 医学院 生理学与病理生理学教研系， 西安 710061； 2．湖北文理学院 医学院机能学部，襄阳 441053； 3．西安电子科技大学 生命科学技术学院生物技术系，西安 710071)

如所周知，小脑深部有3对小脑核团，小脑的所有调节功能均由其3对核团输出。其中间位核最终作用于脊髓运动神经元，其主要功能在于利用外周感觉信息反馈控制肌张力，配合大脑皮层对进行中的肢体运动和肌张力起适时的调节作用。研究资料表明[1-2]，模拟失重条件下肌梭的本体感觉和前庭的传入活动均发生改变，这必然会影响小脑间位核的功能。关于失重或模拟失重条件下肌肉运动系统改变的研究资料很多[3-4]，但是参与调控肌肉运动功能的小脑间位核是否会发生变化，目前未见文献报道。

外周的传入信息主要通过感觉神经末梢释放谷氨酸，激活促离子型谷氨酸受体(ionotropic glutamate receptor，iGluRs)对间位核神经元的活动起兴奋性的调节作用。因此，本研究拟采用免疫组织化学染色技术，观察模拟失重14 d后大鼠小脑间位核内iGluRs免疫反应阳性神经元数量的变化，分析模拟失重对小脑功能的影响，探求模拟失重条件下肌肉运动系统变化的机制, 进而为制定有效的防护措施提供科学的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

本研究采用健康活泼的Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠20只(西安交通大学医学院实验动物中心提供)，体重220～240 g。 按随机配对原则分为2组：模拟失重14 d组(SUS 14 d)及正常对照组(Control, Con)，每组10只动物。

1.2 模拟失重模型的建立

本研究采用经典的Morey式大鼠尾部悬吊法建立模拟失重动物模型[5]。 将大鼠尾部悬吊，使后肢悬空，身体长轴与水平面呈30°，前肢自由活动，动物在笼内可自由活动、进食和饮水。所有动物均采用单笼饲养，室温维持在20～25℃， 每昼夜均保持12 h循环光照与黑暗交替循环。

1.3 标本制备

实验大鼠用戊巴比妥钠腹腔注射(45 mg/kg)麻醉，经主动脉灌流固定，先注入温生理盐水200 mL后，迅速改用4%多聚甲醛灌注2 h。取出大鼠小脑，修整组织块，并置入4%的多聚甲醛固定液后固定4～6 h， 30%蔗糖中4℃过夜。待组织下沉后进行小脑冠状面连续冰冻切片，切片厚度25 μm。常规组织切片裱片，室温晾干，备用。

1.4 iGluRs免疫组织化学染色

分别选用兔抗NMDAR-1(1∶200)、KAR-2(1 μg/mL)和AMPAR-2(1 μg/mL)多克隆抗体 (Chemicon, Internationa, Temecula, CA)作为一抗，按ABC法常规操作进行免疫组织化学染色，用DAB显色。染色后切片进行常规的脱水、透明、封固。阴性对照分别设计针对一抗、二抗的替代试验，即分别用0.01 mol/L PBS来代替一抗，以上对照实验结果均为阴性。

1.5 数据采集及统计分析

在显微镜下(放大倍数10×20)，应用HPIAS-2000 高清晰度彩色医学图文分析系统进行iGluRs免疫组织化学染色阳性细胞计数，取阳性细胞分布均匀的视野计数细胞，计算各视野平均阳性细胞数值。所有实验数据以mean±SEM表示。采用SPSS 10.0软件对实验数据进行统计学分析。组间差异采用非独立样本t检验，以P<0.05作为显著性差异的界值。

2 结果

如图1所示，iGluRs免疫反应染色阳性物呈棕黄色颗粒，主要分布在细胞的核周体及其突起上。iGluRs免疫阳性标记的神经元胞体分散地分布于间位核内。这些细胞多呈圆形、三角形或多极形，细胞大小不均匀，神经元胞体的直径大约为30～80 μm。在缺乏一抗的对照小脑间位核的切片上，没有发现iGluRs免疫反应阳性细胞。

细胞计数结果如表1所示，与正常对照组相比大鼠吊尾14 d后，小脑间位核NMDAR-1、AMPAR-2和KAR-2的免疫反应阳性细胞数均明显增加(P<0.05)。

图1 大鼠小脑间位核促离子型谷氨酸受体免疫组化照片

Bar scale =50 μm. Arrow shows positive immunoreactivity. A1—NMDAR-1 in control group；A2—NMDAR-1 in suspension group; B1—AMPAR-2 in control group；B2—AMPAR-2 in suspension group; C1—KAR-2 in control group； C2—KAR-2 in suspension group.

表1 模拟失重后大鼠小脑间位核iGluRs免疫反应阳性细胞数变化

*P< 0.05 as compared with the control.

iGluRs： ionotropic glutamate receptor； NMDAR-1： N-Methyl-D-Aspartate receptor-1；KAR-2: Kainic acid receptor-2；AMPAR-2: K-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptor-2.

3 讨论

小脑间位核神经元活性受兴奋和抑制两种来源信息的调控。来自小脑皮层浦肯野细胞的轴突，通过末梢释放抑制性递质GABA对间位核神经元的活动起抑制性的调节作用；而来自小脑苔状纤维和爬行纤维的信息，其末梢释放谷氨酸，通过激活iGluRs对间位核神经元的活动起兴奋性的调节作用。

张浩[6]等的研究报道，模拟失重14 d后，大鼠脊髓小脑半球中间区的GABA免疫阳性神经元数量明显减少。Krasnov等的研究表明[7-8]，模拟失重条件下浦肯野细胞功能活动即降低。在本研究中，我们发现：尾部悬吊14 d后，大鼠小脑间位核iGluRs的免疫反应阳性细胞数目明显增多，提示模拟失重可以引起小脑间位核神经元iGluRs的功能增强。以上研究提示失重或模拟失重后，小脑间位核抑制性信息减少，而兴奋性信息增多，即综合的效果可能使小脑间位核的兴奋性增强。

间位核的传出纤维投射到对侧的红核大细胞，后者发出红核脊髓束影响远侧肢体的运动。间位核环路的兴奋性增强，必然会兴奋红核细胞，进而使外周的靶器官活动增多。研究资料表明，人类历经航天飞行后，比目鱼肌的强直肌电活动明显增加[9]。Canu[10]等也曾报道大鼠模拟失重2周后，在假想运动条件下，伸肌神经的自发节律更加频繁甚至连续。以上这些研究也间接提示，失重或模拟失重后，上位运动中枢的下行兴奋作用增强。

综上所述，本研究结果表明，在模拟失重条件下，大鼠小脑间位核神经元iGluRs免疫阳性细胞数明显增多。这一变化可能与失重或模拟失重引起的肌肉运动系统的适应性变化有关。

参考文献:

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[2]Clarke A H, Just K, Krzok W, et al. Listing′s plane and the 3D-VOR in microgravity——the role of the otolith afferences [J]. J Vestib Res, 2013, 23(2):61-70.

[3]Yu Z B. Tetanic contraction induces enhancement of fatigability and sarcomeric damage in atrophic skeletal muscle and its underlying molecular mechanisms [J]. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 2013, 29(6):525-533.

[4]Sandonà D, Desaphy J F, Camerino G M, et al. Adaptation of mouse skeletal muscle to long-term microgravity in the MDS mission [J]. PLoS One, 2012, 7(3):e33232.

[5]Morey E R. Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness [J]. Bioscience, 1979, 29 (3): 168-172.

[6]张 浩, 樊小力， 杨 威. 模拟失重对大鼠脊髓小脑内γ-氨基丁酸免疫反应性的影响 [J]. 中华航空航天医学杂志, 2009, 20(3): 212-215.

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[8]Krasnov I B, Krasnikov G V, Chel′naia N A. Effect of intermittent hypergravity on cerebellum Purkinje′s cells in suspended rats [J]. Aviakosm Ekolog Med, 2009, 43(3):39-43.

[9]Clement G, Gurfinkel V S, Lestienne F, et al. Adaptation of postural control to weightlessness [J]. Exp Brain Res, 1984, 57(1): 61-72.

[10]Canu M H, Falempin M, Orsal D. Fictive motor activity in rat after 14 days of hindlimb unloading [J]. Exp Brain Res, 2001, 139 (1): 30-38.