中温淡盐法制备低核酸酵母抽提物的工艺研究

王 斌， 黄丽娜， 邱丽娟

(1. 江门多微生物科技有限公司， 广东 江门 529000；2. 广东江门生物技术开发中心有限公司， 广东 江门 529000)

食用酵母制品含有丰富的氨基酸、小分子肽类、呈味核苷酸和挥发性芳香化合物等，具有独特的营养保健及调味特性，且不含胆固醇和脂肪酸，是一种已经被认可的天然安全健康食品。因一般酵母中RNA核酸含量较高，约6%～8%[1-2]，对于担忧痛风的人群，酵母的食用受到一定限制[3]。如何将高营养价值且天然安全的酵母开发使用到更广泛的领域，制备低核酸的酵母抽提物将是一种方向。

近年来，一些研究人员对如何分离食物中特别是酵母及其蛋白分离物的核酸这一问题进行了大量的研究，提出高压放电(HVDE)和脉冲电场(PEF)处理[4]、酸处理、碱处理、酶处理、化学修饰、硅藻土-STE法和盐析法等多种方法，这些方法存在对细胞物质不同程度的损伤或不易产业化等问题。其中，采用酸碱工艺可获得已去除96%核酸的脱核蛋白[5]，但产品功能性质较差，经碱处理后易产生对人体肾脏有害的赖丙氨酸。外酶处理生产工序较繁，需较昂贵的酶制剂，比较适合试剂盒提取酵母RNA的应用[6]，内酶处理时间长且收率低。化学修饰法则可能影响必需氨基酸的生物利用率[7]。硅藻土-STE法可获得较纯的RNA[8]，但制备分离蛋白不易产业化。盐析法分离工艺简单，适合工业化生产，但由于盐析法主要采取高温(95～100℃)破壁、浓盐提取RNA的工艺[9]，高温易造成酵母胞内热敏性活性物质(如B族维生素、SOD)等营养成分损失、风味劣变等不良影响，降低产品功能；此外，浓盐法提取率低，提取后的酵母菌体蛋白需经二次分离洗涤去除残留的盐，增加生产成本。

针对上述存在问题，本文主要通过建立一种新的酵母核酸中温淡盐去除法，研究制备低核酸酵母抽提物，避免高温对酵母活性物质的破坏及保留产品风味，且不需脱盐处理，为开发应用范围更广泛地优质酵母抽提物找到一种方便可行的产业化方法，为尿酸偏高及痛风人群食用安全营养的酵母食品提供新的解决方案。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新鲜酵母乳液(RNA含量约为6%～8%)，氯化钠、氢氧化钠、乙酸乙酯、蛋白酶、β-葡聚糖酶。

1.2 主要仪器设备

KDN-102c自动定氮仪，上海纤检仪器有限公司；FE-20酸度计，梅特勒-托利多公司；MX-50水分测定仪，日本AND；LC-6M冷冻离心机，上海离心机械研究所；SHA-B恒温振荡水浴锅，江苏金坛亿通电子有限公司；RE2002旋转蒸发仪，上海博彩仪器设备有限公司；ZG真空干燥机600，常州市振兴干燥设备厂。

1.3 检测方法

1.3.1 酵母浓度分析：用水分测定仪测定。

1.3.2 蛋白质含量分析：凯氏定氮法[10]。

1.3.3 核酸含量分析：采用定磷法[11]。

1.3.4 核酸纯度分析[12]：分别测定样品在260nm处和280nm处的吸光度。如果A260/A280>2.0，说明样品中部分核酸水解为核苷酸和碱基；如果A260/A280<2.0，说明样品中蛋白质含量较高，核酸纯度不足。

1.3.5 核酸提取率计算公式：核酸提取率(%)

1.3.6 氨基酸态氮含量测定：甲醛滴定法[13]。

1.4 工艺路线

2 结果与讨论

2.1 去除酵母核酸工艺条件研究

在不同pH值、温度、质壁分离剂等条件下，用正交试验L16(45)考察10%酵母乳液提取1 h的效果，试验结果见表1和表2。

表1 去除酵母核酸(RNA)正交试验结果

表2 去除酵母核酸(RNA)正交试验结果直观分析

“*”为干基计。

从试验结果可知，随着pH值的升高，上清液中的核酸含量也随之增高，这可能是由于微碱条件会水解酵母细胞壁的可溶性葡聚糖层，改变细胞壁的通透性，有助于核酸渗出[14-15]，但pH值并非越高越好，在强碱条件下大部分核酸会发生水解，不利于去除的核酸进一步开发利用，降低核酸提取率及纯度[16]，同时，强碱处理后的酵母蛋白风味不佳。处理温度对核酸去除率有明显的影响，温度越高，酵母细胞破壁效果越明显，胞内物质释出量也越多。在一些为提高胞内物质得率的研究中也发现，添加乙酸乙酯[14]、氯化钠[17]及β-葡聚糖酶[18]等自溶促进剂，或采取3段变温自溶加酶法[19]，有利于破坏酵母细胞壁结构，改变细胞膜的渗透性，促进酵母胞内内容物尤其是核酸的析出，其中氯化钠具有促进核酸和蛋白质解聚并使蛋白质沉淀的效果[20]，从而提高核酸去除率。

由表1和表2综合分析可知，各因素对酵母核酸去除效果影响的顺序依次是pH值>温度>β-葡聚糖酶>氯化钠>乙酸乙酯。根据正交试验结果确定中温淡盐处理方法，工艺方案为酵母浓度10%，pH值6.5，温度60℃，添加3%食盐、1.0%乙酸乙酯、2‰β-葡聚糖酶处理1 h。

2.2 比较两种去除酵母核酸方法对制备RNA粗品的影响

表3 中温淡盐法与高温浓盐法制备RNA效果比较

“*”，干基计；“**”，高温浓盐法工艺：10%食盐、95℃处理6 h，离心。

用高温浓盐法和中温淡盐法两种工艺分别对酵母进行处理，并离心脱核酸，将含核酸的上清液冷却，并按以下工艺进行RNA粗品的制备：在4000 r/min条件下离心10 min；将上清液用4 mol/L盐酸调pH值至2.4，在4℃冰浴中静置12 h后置于4000 r/min条件下离心10 min，获得酵母核酸沉淀物；用95%乙醇洗涤核酸沉淀物，去除残余的杂质与色素[11]；通过真空干燥方式制成RNA粗品粉末。实验结果见表3。

从表3可知，中温淡盐法较高温浓盐法在制备RNA粗品时，其核酸提取率提高了20.89%，核酸纯度高。

2.3 低核酸酵母抽提物的制备

将经过上述中温淡盐法处理离心脱核酸后的酵母液B，加水稀释到10%浓度，作为试制样，将经过同样工艺处理未离心脱核酸的酵母液A作为对照样，各加入2‰蛋白酶及1.5‰风味酶，于55℃、pH值6.5条件下酶解16 h。酶解液离心，上清液于55℃，-0.09 Mpa真空度下浓缩至可溶性固形物含量为60%～65%，制得酵母抽提物YE-B 及YE-A。实验结果见表4。

表4 酵母抽提物理化指标

*：以干基计。

从表4可知，经脱核酸处理所制得的酵母抽提物YE-B，色浅、肉香味浓郁，且核酸含量(干基计)低至1.18%，比对照酵母抽提物YE-A的核酸(干基计)降低79.19%。制备的低核酸酵母抽提物YE-B其他指标均符合酵母抽提物GB/T23530-2009国标要求[21]。

3 小结

与高温浓盐法去除核酸的方法比较，本文研制的中温淡盐工艺，方法简单，易产业化；不仅核酸去除率高，对核酸的深度开发利用更有利，由此制备的RNA粗品核酸纯度也高；在去除核酸的过程中，未经高温破壁处理，有利于酵母内的热敏营养物质的活性保全，其营养功能价值更高；外观、口感及风味是酵母抽提物用于调味品及营养休闲食品的重要感官指标，本文研制的低核酸酵母抽提物产品，不需脱盐处理，色香味均良好，适合在食品中的应用。

低核酸酵母抽提物的成功开发，将促进天然安全营养的酵母产品广泛应用，并为尿酸偏高及痛风人群提供了新的优质食品。

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