决明子营养价值分析及蛋白提取工艺研究

冯 潜， 刘祖碧， 宋 涛， 焦林涛， 陈胜华， 周嘉裕， 廖 海

(西南交通大学 生命科学与工程学院， 成都 610031)

决明子(Semencassiae)为豆科一年生植物大决明(CassiaobtusifoliaL.)或小决明(CassiatoraL.)的干燥成熟种子。决明子中含有多种有效成分，具有降血压、降血脂、保肝及抑菌等生理活性[1]，是极具营养价值的保健食品，也是国家卫生部公布的69种药食同源的作物之一。蛋白质是决明子的主要药效成分之一，含有大量的人体必需氨基酸及微量元素[2]。与决明子的降压保肝[3]、预防高血脂[4]、增强机体免疫及抗衰老等功能相关[5]。决明子中可大量提取的蛋白质(p55)与人体载脂蛋白B具有相关性，可能通过参与体内脂质的代谢而起到降脂作用[6]。决明子中还存在具有抑制胆固醇合成作用的新蛋白PeakⅡ-3[7]。各类蛋白质的氨基酸组成具有独特的比例，所含的必需氨基酸组成比例越高，则其质量就越优。参照现有的决明子蛋白提取工艺[8]，本研究分析了四川产大决明(CassiaobtusifoliaL.)种子中蛋白质的营养价值，并采用正交试验优化了蛋白质的提取工艺，旨为开发利用甚至工业化提取决明子的营养蛋白，为发展决明子食疗保健产品提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器

相同大小、色泽、饱和度的成熟干燥四川产地决明种子(四川省农业科学院同一批次提供)。

粉碎机；80目筛；烘箱；电子天平(BS224S，Sartorius)；氨基酸分析仪(Elite-AAA，上海禾工仪器)；恒温磁力搅拌器；离心机；透析袋；酶标仪(Synergy H1，博腾仪器)；pH计；可见光分光光度计(V-1100d，上海美谱达仪器)。

1.2 实验试剂

氨基酸标准品(Sigma)；KH2PO4-NaOH缓冲溶液；晶状粉末硫酸铵(分析纯)；牛血清蛋白(BSA，Sigma)标准液浓度1.0 mg/mL，正己烷(分析纯)。

1.3 实验方法

1.3.1 蛋白质提取方法

决明子于60℃烘箱干燥24 h后，用粉碎机粉碎并过80目筛。精确称取决明子粉末10.0 g，60℃下使用正己烷回流脱脂，固液比为1 g∶20 mL，风干后加入KH2PO4-NaOH提取缓冲液，于4～7℃下磁力搅拌提取。再在7℃、5000 r/min的条件下离心10 min。取上清液，并边搅拌边缓慢得往其中加入晶状粉末硫酸铵至饱和。蛋白质在8 h内会达到最大析出量。于7℃、5000 r/min的条件下离心10 min分离出蛋白质沉淀。沉淀置透析袋内于4℃缓冲液中透析2次，每次36 h去除硫酸铵。最后12000 r/min条件下离心10 min，收集上清液备用。

1.3.2 氨基酸测定方法

决明子中氨基酸的含量测定参考国标GB/T 5009.5—2003中食品蛋白质的测定方法[9]。精确称取浓缩蛋白样品20.0 mg于特制水解管底部，加入6 mol/L盐酸10 mL，真空封管后于(110±1)℃水解24 h，水解液冷却后用氢氧化钠中和至pH值4并定容至50 mL。利用Elite-AAA型氨基酸分析系统测定氨基酸组成及含量。

1.3.3 营养价值分析方法

根据联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)在1973年提出的关于评价蛋白质营养价值的必需氨基酸模式[10]，分别按公式(1)、(2)和(3)来计算样本氨基酸的比值RAA(Ratio of Amino Acid)[11]，氨基酸比值系数RC(ratio coefficient of amino acid)以及氨基酸的比值系数得分SRC[12]。根据氨基酸比值系数得分来判断该植物营养价值的高低，越接近100表明营养价值越高。在式(1)中，待评价蛋白质的某必需氨基酸的含量在WHO/FAO模式中均表示为每g蛋白质中有多少mg必需氨基酸。

要进一步解放思想，深化文艺人才工作体制改革，坚持向用人主体放权，为人才松绑，创新人才激励机制，形成有利于各类人才脱颖而出的制度环境。

(1)

(2)

(3)

1.3.4 蛋白标准曲线的制作

蛋白质浓度测定参照文献[13]。

1.3.5 蛋白质提取工艺实验设计

为了考察不同单因素(固液比、缓冲液浓度、提取时间、pH值)对提取效果的影响，设计并顺序考察如下实验方案：

1)分别以固液比为1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，在缓冲液浓度为50 mmol/L，pH值7.0条件下提取12 h，考察不同固液比的提取效果；

2)分别以缓冲液浓度为25、50、100和200 mmol/L，在固液比为1∶50，pH值7.0的条件下提取12 h，考察不同缓冲液浓度的提取效果；

4)分别以缓冲液pH值7.0、8.0、9.0和10.0，在固液比为1∶50，缓冲液浓度为50 mmol/L的条件下提取12 h，考察缓冲液不同pH值的提取效果。

最后每个单因素选取3个最优值进行L9(34)(四因素三水平)正交。

2 结果与讨论

2.1 决明子营养价值分析

实验大决明子中总蛋白质的含量为21.00%。氨基酸总含量为19.66%，其中7种必需氨基酸总含量为6.92%，氨基酸总量占蛋白总量的93.62%。其中各必需氨基酸与氨基酸总量的比值为：缬氨酸0.96%、亮氨酸1.54%、异亮氨酸0.80%、蛋氨酸0.40%、苯丙氨酸0.99%、赖氨酸1.35%及苏氨酸0.88%。各非必需氨基酸与氨基酸总量的比值为：丙氨酸0.95%、脯氨酸0.88%、甘氨酸1.02%、丝氨酸1.18%、胱氨酸0.25%、谷氨酸3.52%、天门冬氨酸2.24%、酪氨酸0.64%、组氨酸0.54%及精氨酸1.52%。色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺未返回数据。氨基酸中含量最多的是谷氨酸和天门冬氨酸，分别为3.52%和2.24%。

根据式(1)、(2)和(3)计算出决明子的RAA， RC以及SRC。为了对决明子营养价值进行较精确的综合评价，选择了其他富含食用蛋白的对照组，包括南瓜叶[14]、鸡蛋[15]、大豆[16]、紫花苜蓿[17]。比较结果见表1，决明的营养价值评分高于大豆、紫花苜蓿，与南瓜接近，略低于鸡蛋。在其食用价值方面具有较高的营养价值。

表1 决明子蛋白的营养价值分析Table 1 The analysis on nutritive value of protein from Semen cassiae

2.2 决明子蛋白质提取单因素分析及正交优化方案

根据蛋白质提取工艺设计，一共进行了13组单因素考察实验。每组10 g过筛决明子粉末，所提取蛋白在测定吸光值后由回归方程计算提取到的蛋白含量，该值与决明子中总蛋白含量为2.1 g的标准参考相比，可计算出每一组单因素考察实验中蛋白质提取的相对效率。结果如表2，当其他因素固定时，固液比最优的3个为1∶50、1∶60、1∶70，缓冲液浓度最优的3个为50、100和200， pH值最优的3个为7、8和9，提取时间最优的3个为12 h、18 h及24 h。分别将选取到的3个最优固液比(A)、缓冲液浓度(B)、缓冲液pH(C)、及提取时间(D)进行L9(34)四因素三水平正交试验，结果如表3。

表2 决明子蛋白质提取单因素实验结果Table 2 Experimental results of single factor on protein extraction of fromSemen cassiae

表3 正交实验因素水平Table 3 The factor level of the orthogonality experiment

3 结论

在决明子蛋白的营养价值分析中，决明子的营养价值评分高于大豆、紫花苜蓿，与南瓜接近，略低于鸡蛋。表明决明子在作为药物使用的同时，也能达到补充优质蛋白质的的效果。在决明子蛋白的提取试验中，影响决明子蛋白提取率的因素顺序依次为：缓冲液浓度>缓冲液pH>固液比>提取时间。通过正交试验获得碱性缓冲液提取法提取决明子蛋白的最佳工艺条件为：料液比1 g∶50 mL，缓冲液浓度50 mmol/L，缓冲液pH值8.0，提取时间12 h。此条件下决明子蛋白提取率为93.3%。单因素实验显示：在料液比1∶50的基础上添加更多的提取液反而使提取率下降，可能是提取、浓缩等过程产生了物料损失；在12 h的基础上延长提取时间使提取率下降，可能与蛋白质体外降解有关。

表4 正交试验的直观分析Table 4 The analysis on the orthogonal experiment

[1]吕翠婷, 黎海彬, 李续娥, 等. 中药决明子的研究进展[J]. 食品科技, 2006, 8(3): 295-298.

[2]刘训红, 王玉玺. 决明子中营养成分分析[J]. 时珍国医国药, 2000, 11(10): 865-866.

[3]李续娥，郭宝江，曾 志 . 决明子蛋白质、低聚糖及蒽醌苷降压作用的实验研究[J]. 中草药, 2003, 34(9): 842-843.

[4]李续娥, 郭宝江. 决明子蛋白质和蒽醌苷对高脂血症大鼠血脂的影响[J]. 中国中药杂志, 2002, 27(5): 374-375.

[5]刘 斌, 巩鸿霞, 肖学凤, 等. 决明子化学成分及药理作用研究进展[J]. Drug Evaluation Research, 2010, 33(4).312-315.

[6]李续娥，杨水云，赵文明. 中药决明子蛋白质的提取分离及部分一级结构的确定[J]. 西安交通大学学报, 2001, 35(7): 764-767.

[7]李楚华，李 梅，常文瑞，等. 决明子中一种新的降脂蛋白的纯化与生化特性[J]. 中国科学C刊：生命科学, 2008, 38(11): 1036-1040.

[8]李红艳, 邓泽元, 单 斌. 决明子蛋白质提取工艺研究及其体外消化率的测定[J]. 食品科技, 2008, 5: 72-74.

[9]杨玉芳. 蛋白质含量测定方法[J]. 明胶科学与技术, 2007, 27(2): 98-101.

[10]Mann J, Cummings J H, Englyst H N, et al. FAO/WHO scientific update on carbohydrates in human nutrition: conclusions[J]. European Journal of Clinical Nutrition, 2007, 61: 132-137.

[11]Kimura T, Bier D M, Taylor C L. Summary of workshop discussions on establishing upper limits for amino acids with specific attention to available data for the essential amino acids leucine and tryptophan[J]. The Journal of Nutrition, 2012, 142(12): 2245-2248.

[12]Liu G, Wang H, Zhou B H, et al. Compositional analysis and nutritional studies ofTricholomamatsutakecollected from Southwest China[J]. Journal of Medicinal Plants Research, 2010, 4: 1222-1227.

[13]王孝平, 邢树礼. 考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[J]. 天津化工, 2009, 23(3): 40-41.

[14]黄 威, 吴文标. 南瓜叶蛋白营养价值的化学评价[J]. 食品研究与开发, 2010, 31(1): 151-154.

[15]徐桂云. 鸡蛋品质及营养价值的新认识[J]. 中国家禽, 2012, 34(13): 33-38.

[16]李 慧, 倪志强, 冯 涛, 等. 胡卢巴与大豆营养成分比较分析[J]. 食品科技, 2013 (2): 50-52.

[17]何 云, 霍文颖, 张海棠, 等. 紫花苜蓿的营养价值及其影响因素[J]. 安徽农业科学, 2007, 35(11): 3243-3244.