甲基睾酮(MT)和加氢甲基睾酮(MDHT)浸泡法诱导尼罗罗非鱼仔鱼雄性化的对比研究*

陈兴汉，李 波，叶 卫，张 勇

(1.阳江职业技术学院生命科学与技术系，广东 阳江 529566；2.中山大学水生经济动物研究所，广东 广州 510275；3.番禺国家级罗非鱼良种场,广东 广州 511453)

罗非鱼属于鲈形目(Perciformes)、丽鱼科(Cichidae)、罗非鱼属(Oreochromis)，具有肉质好、生长快、抗逆性强、养殖成本低以及加工出肉率高等优点，养殖区域已遍布世界 70 多个国家和地区。近年来我国罗非鱼产量和出口量一直稳居世界第1位[1]，罗非鱼是我国主要的产业化养殖和世界大宗贸易对象[2]。但制约罗非鱼产业化养殖推广最突出的问题是繁殖泛滥，其性成熟早，一年可繁殖好几代，大大降低了商品鱼的规格，严重浪费养殖资源，而且造成品种混杂，对生态安全有较大威胁[3]。罗非鱼是雄性优势生长种类，雄鱼比雌鱼生长快 40％～50％[4]，因此，以单雄性的方式进行推广养殖是稳定高产的前提，其关键技术是“通过性别控制手段以获得雄性化鱼苗”，生产上最常用的是通过雄激素定向诱导。

用激素控制鱼类的性别，在美国、日本、菲律宾，以色列以及我国台湾等国家和地区进行了广泛研究。到目前为止，至少有31种激素在50种鱼类中成功进行定向诱导或诱导性逆转，其中有大约16种雄激素，成功进行雄性化诱导的鱼类有35种[5]，应用最广泛的是甲基睾酮(MT)，但MT的诱导效果不稳定，主要是因为MT是可芳香化的[6-7]，少量的MT不能起到明显提高雄性率的效果，过量反而会使雄性率下降或导致不育[8]。而加氢甲基睾酮(MDHT)的诱导效果比MT更稳定，Piferrer[6]、Gale[9]和Wassermann[10]等学者对尼罗罗非鱼的研究结果都证明了这一点。MDHT 是不可芳香化的[6,9]，在鱼体内不会被芳香化酶催化变成雌激素而导致雌性增多，在高 MDHT 剂量处理时，尚未见导致不育的报道。

在处理方式上，目前应用“投喂法”诱导雄性化最为常见，至少已在青鳉、金鱼、鲤、花鳉、斑马鱼、虹鳟、大西洋鲑、大麻哈鱼、罗非鱼等雌雄异体鱼类中获得成功[11]。有学者研究发现：在鱼苗性分化前投喂一段时间的MT都能诱导罗非鱼雄性化[12-14]。投喂法虽有效，但长时间大量使用激素会导致环境污染，极少量残留也会危害人体健康[15-16]。有关“浸泡法”诱导雄性化的研究，国内只有少量浸泡催产或排卵的报道[17-18]、尚未见“浸泡法”诱导雄性化的报道，国外有少量研究报道[9-10,19]。“浸泡法”是在仔鱼发育的特定时期，在专门的容器里进行短时间的集中处理，此法所用激素剂量小，避免了对养殖水体的污染。本研究旨在探索一种简易、稳定又环保的雄激素“浸泡法”诱导尼罗罗非鱼仔鱼雄性化，为生产实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验用鱼 尼罗罗非鱼仔鱼取样于广东省国家级罗非鱼良种场(番禺)。选取健壮、无病，卵颗粒大、发亮，卵粒偏黄，鱼体色发红的雌鱼作为母本；同时选择健壮，无病，可以挤出白色精液的雄鱼作为父本。雌雄(1 ∶ 1)饲养于4 m×1.5 m×1.2 m(长×宽×深)水泥池。投喂普通罗非鱼成鱼饲料，保持微流水。雌鱼自行产卵孵化。在仔鱼孵出前 1～2 d，把卵从亲鱼口腔中取出，在孵化装置中孵化。待仔鱼全部孵出后，饲养于规格为40 cm×25 cm×25 cm(长×宽×高)的白色塑料箱中。按孵出后天数(DPH,Days Post Hactching)计，分别于1 DPH(出膜第1天)、7 DPH(卵黄囊消失)和13 DPH时再分组进行试验，每组100尾鱼。所有的鱼池、用品都做常规消毒。

1.1.2 药品和试剂 MT购自Sigama(USA)公司，MDHT为MD(USA)公司产品。计算出一次实验所需MT或MDHT的总剂量，然后称取盛放于一棕色玻璃瓶中(体积约15 mL)，再加入分析纯酒精(φ=99％)溶解，使保存剂量为c= 10 μg·μL-1，充分振荡溶解后放入 4 ℃ 冰箱保存，实验时再取用。雌雄性腺鉴别时采用铁醋酸洋红和结晶紫染色。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计 MT和MDHT试验设计采用简单比较法正交试验[20]，略作修正。处理时期(Treatment period)分别为1,7,13 DPH，激素剂量(Hormone dose)分别为200,600,1 800,5 400 μg·L-1，持续时间(Treatment duration)分别为 2,4,8 h。每个处理组设两个平行，另设两个自然对照组(Ctr)。激素浸泡处理时，把仔鱼分装于约5 L的玻璃缸后，向每个缸里放一个充气石，保证缸里供氧充足及激素混合均匀。准备开始进行激素浸泡处理时，用加样枪吸取所需体积的MT或MDHT溶液(保存剂量为10 μg·μL-1)加入玻璃缸，以所需体积最大的那个缸为基准，向其它缸里加入相应分析纯酒精(φ=99％)，以补充酒精体积差值，消除由于水体酒精剂量不同而带来的误差。处理持续时间结束时，把仔鱼捞出，在清水里洗两遍，然后转到规格为50 cm×50 cm×50 cm 的网箱中。网箱悬挂于水泥池中，保持微流水，每天清洗网箱一次，每天投喂鳗鱼饲料3次。饲养至60 DPH，存活的鱼全部进行性别检测。

1.2.2 性别检测 待鱼饲养至60 DPH时，通过性腺压片分辨雌雄，人工解剖取性腺，解剖前向鱼体腔注射约1 mL的φ=5％醋酸溶液，使性腺变白，以利于取出性腺。性腺取出后，滴少许铁醋酸洋红进行染色，压片后在 ZEISS 显微镜下观察判断雌雄。雌鱼性腺表面可见清晰卵粒，雄鱼性腺表面无清晰细胞间隔。如压片不能清楚分辨雌雄时，揭开盖玻片，滴少许结晶紫溶液，见到明显卵细胞的为雌性，无卵细胞样的则为雄性。

1.3 数据分析

采用Excel2003进行数据整理，并运用SPSS18.0版本进行差异显著性分析。用卡方(χ2)检验[20-21]比较各组的雄性率的差异，进行多重比较时，为了降低Ⅰ类误差，采用Bonferroni校正法对显著性水平进行校正，校正的显著性水平α′=α/比较次数[3]。

为了解MT、MDHT诱导7 DPH与13 DPH仔鱼雄性率的差异，需对7 DPH与13 DPH雄性率最高的组进行两个百分数样本差异显著性t检验[22]，在 Excel 2003里编辑公式(1)，根据公式(1)求得t值，然后查t分布表，以比较差异的显著性。

(1)

(1)式中，x1为第一样本中某事件发生的次数，x2为第二样本中某事件发生的次数，n1为第一个样本含量，n2为第二个样本含量，SQRT 表示返回数值的算术平方根。

2 结 果

2.1 MT与MDHT浸泡诱导1 DPH仔鱼的雄性率

由图1可知：处理时期为1 DPH，持续时间为 4 h 时，不同MT、MDHT 剂量组(200,600,1 800,5 400 μg·L-1)的雄性率和对照组(Ctr)比较没有显著差异(P>0.05)，各组间两两比较也没有显著差异(P>0.05)。

图1 处理时期为1 DPH，持续时间为 4 h时，不同MT、MDHT剂量组的雄性率

由图2可知：处理时期为 1 DPH，MT或MDHT剂量为600 μg·L-1时，不同持续时间组(2,4,8 h)的雄性率和对照组比较没有显著差异(P>0.05)，各组间两两比较也没有显著差异(P>0.05)。这说明用MT 或MDHT 浸泡诱导1 DPH的仔鱼时，激素剂量为200,600,1 800或5 400 μg·L-1，持续时间为2,4或8 h，都不能显著提高雄性率。

图2 处理时期为1 DPH，MT、MDHT剂量为600 μg·L-1 时，不同持续时间组的雄性率

2.2 MT与MDHT浸泡诱导7 DPH仔鱼的雄性率

由图3可知：处理时期为 7 DPH，持续时间为4 h时，不同MT、MDHT剂量组(200,600,1 800,5 400 μg·L-1)的雄性率都显著高于对照组(P<0.05)，MT(1 800,5 400 μg·L-1)两组的雄性率显著低于 MT(600 μg·L-1)、MDHT(600,1 800 μg·L-1)三组(P<0.05)，MDHT各剂量组(200,600,1 800,5 400 μg·L-1)两两比较无显著差异(P>0.05)。这表明当MT诱导 7 DPH 仔鱼的剂量为600 μg·L-1时雄性率最高，而剂量为1 800,5 400 μg·L-1时雄性率明显下降；MDHT 的剂量为600,1 800 μg·L-1时雄性率最高，同时剂量为200,5 400 μg·L-1时雄性率没有明显下降。

图3 处理时期为7 DPH，持续时间为4 h时，不同MT、MDHT 剂量组的雄性率

图4 处理时期为7 DPH，MT、MDHT剂量为 600 μg·L-1时，不同持续时间组的雄性率

由图4 可知：处理时期为 7 DPH，MT或MDHT剂量为600 μg·L-1时，不同持续时间组(2,4,8 h)的雄性率都显著高于对照组 (P<0.05)，MT(8 h)组的雄性率显著低于MT(4 h)组的雄性率(P<0.05)，MDHT各持续时间组(2,4,8 h)两两比较无显著差异(P>0.05)。这表明当用MT诱导7 DPH仔鱼时，持续时间为 4 h 效果最好、而 8 h的雄性率降低；当用MDHT时，3个持续时间组(2,4,8 h)的雄性率无显著差异。

2.3 MT与MDHT浸泡诱导13 DPH仔鱼的雄性率

由图5 可知：处理时期为 13 DPH，持续时间为4 h时，MT(200,600,1 800 μg·L-1)及 MDHT(200，600 μg·L-1)这5组的雄性率显著高于对照组(P<0.05)，MT(200 μg·L-1)和 MDHT(200 μg·L-1) 2组雄性率最高、分别为87.62％和82.31％。MT(5 400 μg·L-1)、MDHT(1 800,5 400 μg·L-1)这3组的雄性率和对照组比较无显著差异(P>0.05)，MT(5 400 μg·L-1)组的雄性率显著低于MT(200; 600 μg·L-1)和MDHT(200 μg·L-1)3组(P<0.05)，MDHT 各剂量组(200,600,1 800,5 400 μg·L-1)两两比较无显著差异(P>0.05)。

图5 处理时期为13 DPH，持续时间为4 h时，不同MT、MDHT 剂量组的雄性率

由图6 可知：处理时期为 13 DPH，MT或MDHT剂量为200 μg·L-1时，MT(2,4 h)和MDHT(2,4 h)这4组的雄性率显著高于对照组(P<0.05)，MT(8 h)组的雄性率显著低于MT(4 h)组(P<0.05),与MT(2 h)组无显著差异(P>0.05)，MDHT 各持续时间组(2,4,8 h)两两比较无显著差异(P>0.05)。

图6 处理时期为13 DPH，MT、MDHT剂量为200 μg·L-1 时，不同持续时间组的雄性率

2.4 MT与MDHT浸泡诱导7 DPH与13 DPH仔鱼最高雄性率的t检验

结合图3-6 可知，MT、MDHT 浸泡诱导7 DPH与13 DPH仔鱼雄性率最高的处理组合(DPH-h-μg·L-1)分别为：MDHT(7-4-600)、MT(7-4-600)、MT(13-4-200)和MDHT(13-4-200)这4组，雄性率分别为98.81％、98.34％、87.62％和 82.31％。这4组分别进行了2个百分数样本差异显著性t检验(见图 7)。结果为：MDHT(7-4-600)、MT(7-4-600)这2组的雄性率显著高于 MT(13-4-200)、MDHT(13-4-200)这2组(P<0.05)，MDHT(7-4-600)与 MT(7-4-600)两组间无显著差异(P>0.05)，MT(13-4-200)与 MDHT(13-4-200)两组间也无显著差异(P>0.05)。这证明 MT、MDHT 浸泡诱导 7 DPH仔鱼的雄性率要显著高于诱导 13 DPH仔鱼的雄性率。

图7 MT 与 MDHT诱导 7 DPH 与 13 DPH 仔鱼最高雄性率的t检验

3 讨 论

3.1 激素敏感期

激素敏感期(Hormone sensitive period)是指动物胚胎发育的某一特定阶段，在该阶段内激素能对性别决定起主导作用[23-24]。如要使用激素实现性别的定向诱导，首先要确定激素敏感期。从本文的结果看，MT、MDHT诱导7 DPH尼罗罗非鱼仔鱼的雄性率最高分别为98.81％和98.34％。Gale等[9]用MT和MDHT分别浸泡处理了尼罗罗非鱼，处理剂量为500 μg·L-1、处理时期为13 DPF(Days post fertilization，受精后 13 d，相当于7 DPH)、持续时间为 3 h，雄性率分别达87％和94％；Wassermann和Afonso[10]也用MT和MDHT浸泡处理了尼罗罗非鱼，处理剂量为1 800 μg·L-1、处理时期为14 DPF(相当于7～8 DPH)、持续时间为 4 h，雄性率分别达91.6％和100％。另外，我们的研究结果通过t检验证明，13 DPH仔鱼也具有激素敏感性，只是不如7 DPH仔鱼激素敏感性高。以上结果表明：尼罗罗非鱼仔鱼的激素敏感期应为包括7 DPH在内的一个“时段”。此时生殖脊开始出现、原始性腺尚未形成[25]，推测这个“时段”应该在生殖脊开始出现到原始性腺形成之前，此时性腺发育具有较强的两性分化可塑性[26]。但具体确定这个“时段”还有待进一步研究。

3.2 MT与MDHT的诱导效果对比

本文结果发现：MT诱导7 DPH仔鱼的剂量为600 μg·L-1时，雄性率最高(98.81％)；MDHT 的剂量为600,1 800 μg·L-1时，雄性率最高(分别为98.34％、98.39％)。当用MT诱导7 DPH仔鱼时，持续时间为4 h雄性率最高；当用MDHT时，3种持续时间组(2,4,8 h)的雄性率都较高。Gale等[9]所采用的MT和MDHT处理剂量为500 μg·L-1，持续时间为3 h，雄性率分别为87％和94％。相比较而言，本试验的雄性率更高，这可能是Gale等所采用剂量500 μg·L-1和持续时间3 h与本研究的600 μg·L-1和4 h有所差异引起的。Wassermann和Afonso[10]所采用的MT和MDHT处理剂量为1 800 μg·L-1，持续时间为4 h，雄性率分别为91.6％和100％。这和本文结果相符。

本试验研究还发现：MT诱导7 DPH仔鱼的剂量为1 800 μg·L-1和5 400 μg·L-1时，雄性率相比 200 μg·L-1和600 μg·L-1而言明显下降(P<0.05)；而 MDHT各剂量组(200,600,1 800,5 400 μg·L-1)的雄性率无显著差异(P>0.05)。当用MT诱导7 DPH仔鱼时，持续时间为4 h效果最好、而8 h的效果有所下降；当用MDHT时，3种持续时间组(2,4,8 h)的雄性率无显著差异(P>0.05)。这些现象可能与MT可芳香化[6-7]有关，当 MT 剂量较高(1 800,5 400 μg·L-1)或持续时间较长(8 h)时，过量的 MT 在芳香化酶的催化下产生雌二醇(E2)[27]，从而导致雄性率相对降低。MDHT是不可芳化的[6,9]，相对于可芳化的 MT 而言，MDHT剂量较高(1 800,5 400 μg·L-1)和持续时间较长(8 h)时，雄性率并无显著降低，且MDHT剂量较低(200 μg·L-1)和持续时间较短(2 h)时，雄性率也无显著降低。因此，总体而言 MDHT 浸泡诱导雄性化的稳定性较 MT 好，MDHT表现出更好的应用潜力。

3.3 “浸泡法”的应用前景

本文结果表明，运用MT和MDHT浸泡诱导尼罗罗非鱼仔鱼雄性化的雄性率最高分别可达98.81％和98.39％，雄性率能够达到生产应用需求。尤其是MDHT表现出更好的应用潜力。诱导雄性化不光在生产上应用，在科研中也有着巨大的应用价值，性反转鱼在性别决定机制、染色体组学和三系配套技术[28-29]等研究中早有应用，通过“浸泡法”得到的“转化系”的鱼，必将为这些基础理论的研究提供新的研究题材。

传统的激素诱导处理方式有投喂法、注射法和埋植法。投喂法最为常见，使用时先把激素溶解在酒精中，然后拌入饲料中投喂，此法虽有效，但在鱼的消化过程中激素的效应会降低，而且投喂法耗时长、激素用量大，会导致环境污染，极少量残留也会危害人体健康[15-16]；注射法和埋植法费时费力，一般只在科研中有应用价值，而且不能应用于胚胎或仔鱼，这也限制了其推广使用；“浸泡法”是一门新兴的技术，已在大马哈鱼中成功应用[6,30]，其方法简便易行，一般在专门的容器或装置进行短时间的集中处理，由于浸泡激素呈全面均匀分散进入鱼体皮下组织内，机体组织吸收效果好，此法所用激素剂量小，避免了对养殖水体的污染，这对保护生态环境有着较为重要的意义。

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