淫羊藿苷对AD细胞模型CREB表达的影响及机制研究

郑桃林 王 哲 刘 超 何 伟

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是老年痴呆的一种最常见类型，是一种多因素引起的进行性神经系统退行性疾病。大多数学者认为，β－样淀粉样多肽（β－amyloid，Aβ）沉积以及tau蛋白磷酸化、老年斑形成（senile plaques，SP）、神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NETS）是其病理学特征。Aβ具有神经毒性，当前应用Aβ25－35片段诱导PC12细胞损伤建立AD细胞模型已被广泛用于体外研究实验。cAMP反应序列结合蛋白（cAMP responsive element binding protein CREB）是一种重要的核转录因子，调节启动子中具有环磷酸腺苷反应单元（CRE）的基因转录，在神经元再生、突触形成及学习记忆等方面具有重要的调节作用。临床资料显示，在AD患者海马组织cAMP水平下降，CREB、磷酸化的CREB（phosphorylated CREB，p－CREB）水平相应下降，证实CREB、P－CREB与AD的形成有密切的关系。

淫羊藿苷（Icariin，ICA）是一种从小檗科淫羊藿属植物中提取的黄酮类化合物。现代药理学研究ICA具有多方面的药理作用，近年来淫羊藿苷在中枢神经系统的药理作用及其机制研究日益增多，具有抗痴呆、抗衰老、抗抑郁、改善缺血性脑损伤等作用［1，2］。本课题组前期临床及实验研究发现，以淫羊藿为君药的中药小复方（脑灵汤）具有一定的抗痴呆作用［3，4］，并发现其能上调模型鼠海马P－CREB的表达水平，从而改善模型鼠的学习、记忆能力［5］，但其具体机制仍不十分清楚。根据以上前期研究，并参考现代药理学的研究，本实验选用中药单体淫羊藿提取物ICA作为实验材料，以采用Aβ25－35孵育的PC12细胞构建AD细胞模型为基础，探讨ICA抗痴呆的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

PC12细胞购自中国医学科学院。淫羊藿苷由中国食品药品鉴定研究院提供。Aβ25－35购自美国Sigma公司，胰蛋白酶购自江苏碧云天生物科技研究所，胎牛血清购自Gibco公司，DMEM培养基购自Solarbio公司，羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗购自美国Jackson公司，Bradford蛋白浓度测定试剂盒、超敏化学放光显色试剂盒均购自江苏碧云天生物科技研究所。

1.2 方法

1.2.1 PC12细胞的培养

PC12细胞的培养液成分为90%高糖DMEM培养基（含青霉素及链霉素浓度均为100 U／ml）和10%胎牛血清；二氧化碳培养箱中条件设置为37℃、5%CO2、饱和湿度；更换细胞培养液频率约为2～3次／d，待细胞达70%～80%丰度时进行传代；药物干预及各项指标检测均取对数生长期的细胞。

1.2.2 Aβ25－35孵育PC12细胞制备AD细胞模型

将1 mg纯度为97%的Aβ25－35溶于双蒸水中使其终浓度为1μmol／mL，放置于－20℃冰箱备用；临用前置于37℃孵育1周，使其凝聚；取对数生长期的PC12细胞调节其细胞浓度1×105／ml；取调节好浓度的细胞培养液约2 ml接种于6孔板置于二氧化碳培养箱中培养24 h，24 h后加入Aβ继续培养24 h，然后收集细胞。

1.2.3 实验分组

实验分为对照组、Aβ组、ICA组、LY组、LY＋ICA组；除Control组外，余下4组Aβ的浓度均为20μmol／L；ICA组：先加ICA孵育1 h后再加Aβ，ICA浓度为20μmol／L；LY组的LY294002浓度为50μmol／L；LY＋ICA组为先加LY294002浓度为50μmol／L孵育1 h，再加ICA和Aβ使其浓度为20μmol／L。LY294002为PI3K／Akt信号通路经典抑制剂。

1.2.4 Western－Blot检测CREB、p－CREB、Akt、p－Akt蛋白表达水平

将细胞收集于干净Ep管中，取蛋白裂解液按每1×106个细胞加200 ul蛋白裂解液；RIPA裂解液处理细胞，提取细胞总蛋白；Bradford法测定各组样品蛋白质含量；SDS－PAGE凝胶电泳，转膜后用抗体孵育和显色，将胶片进行扫描，用图像分析软件IPP6.0对图像进行灰度分析。电泳：浓缩胶50 V，分离胶100 V，电泳时间3 h左右；转膜：CREB1，p－CREB1，AKT，p－AKT，380 mA1.5 h。封闭：5%脱脂牛奶（TBST稀释），37℃2 h；一抗孵育：4℃孵育过夜（TBST稀释）；洗膜：TBST，每次5 min，共6次；二抗孵育：室温1 h（TBST稀释，羊二抗1∶5000，兔 二 抗1∶4000、鼠 二 抗1∶2000）；洗 膜：TBST，每次5 min，共6次；显影：曝光时间2～10 min。

1.2.5 统计学处理

所得数据用均数±标准差（¯x±s）表示，采用SPSS18.0统计软件处理实验数据，多组间比较先进行方差齐性检验，若方差齐则进行单因素方差分析的单向分类方差分析。进行多个样本均数间的两两比较则采用LSD－t检验。若方差不齐则进行变量转化后采用单向类方差分析或采用Kruskal－Wills H检验，多个样本均数间的两两比较采用Nemenyi检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组细胞CREB、P－CREB表达水平的比较

各组培养结束后Western blot法检测各组细胞P－CREB（Ser－133）、CREB蛋白表达水平，利用IPP测量平均灰度值。在相对分子量为43 kD处，可见清晰的P－CREB、CREB条带，以GAPDH为内参。与对照组比较，Aβ处理PC12细胞使P－CREB／CREB表达下调，差异有显著性（P＜0.01）；与Aβ组比较，ICA能够明显增加P－CREB／CREB比值，差异有显著性（P＜0.01）；与ICA组相比较，ICA＋LY组加入LY预处理后下调P－CREB／CREB表达水平，差异有显著性（P＜0.05）（表1、图1）。

图1 Western－blot检测各组CREB、P－CREB蛋白表达水平

表1 各组PC12细胞P－CREB／CREB表达水平比较（¯x±s）

2.2 各组Akt与p－Akt蛋白表达水平的比较

各组培养结束后Western blot法检测各组细胞Akt及P－AktSer－473的蛋白表达水平，利用IPP测量平均灰度值。在相对分子量为60 kD处，可见清晰的P－Akt、T－Akt条带，以β－actin为内参。与对照组比较，Aβ组p－Akt水平明显下降，差异有显著性（P＜0.01）；与Aβ组比较，ICA组p－Akt水平明显增高，差异有显著性（P＜0.01）；与ICA组比较，ICA＋LY组p－Akt水平明显下降，差异有显著性（P＜0.01）（表2、图2）。

图2 Western－blot检测的各组Akt、p－Akt蛋白表达水平

表2 Western blot法检测的各组Akt磷酸化水平（¯x±s）

3 讨 论

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种多因素引起的中枢神经系统退行性疾病。AD以获得性持续进行性记忆减退、认知功能障碍、言语障碍、时间与空间定向能力障碍、行为异常以及性格改变为特征。AD发病机制目前仍不清楚，在众多关于AD发病机制的假说中目前被普遍接受的是Aβ级联反应假说［6］。Aβ级联反应假说核心理论：在遗传或环境因素改变的情况下脑内生成具有神经毒性作用的β淀粉样蛋白，Aβ通过一系列复杂的病理机制导致大脑神经元变性、缺失，最终导致认知功能损害，即脑内异常沉积的Aβ是造成AD记忆认知损伤的始动因素，是诱发该病的中心环节。

CREB是细胞存活所必备的蛋白分子之一［7］。临床资料显示，AD患者海马组织CAMP水平下降，CREB、磷酸化的CREB水平相应下降，证实CREB、P－CREB与AD的形成有密切的关系。有研究显示过量Aβ可抑制海马cAMP／PKA／cREB信号通路，致海马CAI LTM功能的损害，进而影响突触可塑性，导致学习记忆障碍。本研究也发现Aβ组与对照组比较，P－CREB／CREB表达水平下降。研究报道淫羊藿苷（ICA）可以改善脑卒中后痴呆动物模型的学习记忆能力，并能够增加CREB的磷酸化水平［8］。本研究发现与Aβ组比较，ICA使PCREB表达明显上调，进一步证明ICA可以促进CREB磷酸化，上调P－CREB的表达水平而发挥保护作用。近年来关于淫羊藿苷在中枢神经系统的药理作用及其机制研究日益增多，且表明其具有抗抑郁、改善缺血性脑损伤、抗痴呆、抗衰老作用［1，2］。淫羊藿苷可以通过抗氧化应激损伤、平衡细胞内钙离子流稳态、抑制β分泌酶表达、纠正能量代谢失衡等方式抗Aβ毒性［9，10］。本实验发现与Aβ组比较，ICA组P－CREB表达水平明显上调，这进一步证明ICA可以促进CREBser－133磷酸化，上调P－CREB的表达而发挥细胞保护作用。

Akt是一种丝氨酸／苏氨酸激酶，一般在Ser－473和Thr－308位点磷酸化而激活，能介导多种生物学效应，与多样化角色相关如调节细胞生长、增殖、迁移、糖代谢、转录、蛋白合成、血管生成和细胞存活［11］。PI3K／Akt信号通路是细胞内重要的促细胞存活转导途径。Akt可正性调节cAMP反应元件结合蛋白（CREB）转录因子，直接磷酸化CREB，Akt磷酸化CREB后使CREB连接到相应的启动子区，诱导cAMP反应元件基因表达。PI3K／Akt信号通路激活后引起CREBSer－133磷酸化，促进一些蛋白的转录而维持细胞存活［12］。JosephPeltier等在对PI3K／Akt／CREB调控成人海马祖细胞增殖研究中发现，cAMP反应序列结合蛋白的激活发生在被碱性成纤维细胞生长因子（FGF－2）刺激的细胞中，当Akt信号被抑制时CREB的活化受限［13］，表明Akt信号部分通过CREB介导，Akt和CREB之间存在链接。磷酸化的CREB直接或间接激活相关基因的转录，进而表达某些蛋白分子如c－fos、bcl－2以及某些神经营养因子如碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经生长因子（Brain－Derived Neurotrophic Factor，BDNF）等，这些基因产物调节着神经元在应激性损伤后的再生、存活和修复。CREB可以增加BDNF等可以激活PI3K／Akt信号通路的蛋白分子表达而形成正反馈促进细胞存活［14］。激活PI3K／Akt通路可以引起CREB的磷酸化，而CREB磷酸化可以增加BDNF的表达，反过来BDNF可以通过激活PI3K／Akt信号通路拮抗Aβ神经毒作用，减少Aβ引起的神经元凋亡，促神经元存活，改善突触可塑性，改善认知功能障碍［15］。

本实验观察到与ICA组比较，ICA＋LY组PCREB／CREB表达水平下调，提示ICA预处理能够促进CREB磷酸化，上调P－CREB表达，PI3K／Akt抑制剂LY294002能够抑制ICA诱导的CREB磷酸化。本实验亦发现LY阻断PI3K／Akt信号通路后，ICA处理不仅仍可以上调P－CREB的表达水平，而且P－Akt／Akt的表达水平也上调。考虑ICA有可能通过别的通路发挥其对神经细胞的保护作用，其保护机制可能是通过多层次、多途径、多靶点来实现的。总之，本实验结果证实了ICA可增加Aβ25－35诱导的PC12细胞中p－CREB表达水平，其作用机制可能与调控PI3K／Akt通路有关，这为今后治疗AD提供了新的靶点，但仍然有许多问题需进一步研究，如ICA通过活化Akt还对下游哪些蛋白发挥作用、除了该通路是否其保护作用还与别的通路有关等。另外，AD发病生理病理机制都十分复杂，在治疗该疾病时要想有效控制该病临床症状及病程发展，不能只局限在某一种或某一类药物，必须采取多途径、多靶点、多方位综合治疗，这可能会成为未来治疗AD的一种新趋势。

1 Zhu HR，Wang ZY，Zhu XL，et al.Icariin protects against brain injury by enhancing SIRTI－dependent PGC－lalpha expression in experimental stroke.Neuropharmacology，2010，59（1－2）：70－76.

2 He XL，Zhou WQ，Bi MG，et al.Neuroprotective effects of icariin on memory impairment and neurochemical deficits in senescence－accelerated mouse prone 8（SAMP8）mice.Brain Res，2010，13（34）：73－83.

3 王 哲，伍明辉，钟炳武，等.脑灵汤对阿尔茨海默病大鼠模型行为学及海马CA3区小胶质细胞和IL－6表达的影响.中南大学学报，2013，38（2）：114－119.

4 盛晨霞，何明大，苏南湘，等.脑灵汤对Alzheimer病模型大鼠行为学及海马胆碱能神经系统的影响.现代中西医结合杂志，2009，18（33）：4066－4068.

5 钟炳武，王 哲，何明大.脑灵汤对阿尔茨海默病模型大鼠行为学及海马CA3区淀粉样前体蛋白表达的影响.中南大学学报，2010，35（5）：431－437.

6 Karran E，Mercken M，De Strooper B.The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer＇s disease：an appraisal for the development of therapeutics.Nat Rev Drug Discov，2011，10（9）：698－712.

7 Altarejos JY，Montminy M.CREB and the CRTC co－activators：sensors for hormonal and metabolic signals.Nat Rev Mol Cell Biol，2011，12（3）：141－151.

8 Wang X，Li J，Qian L，et al.Icariin promotes histone acetylation and attenuates post－stroke cognitive impairment in the central cholinergic circuits of mice.Neuroscience，2013，236（6）：281－288.

9 Nie J，Luo Y，Huang XN，et al.Icariin inhibits beta－amyloid peptide segment25－35induced expression of b te－secretasc in rat hippocampus.Eur J Pharmacol，2010，626（2－3）：213－218.

10 Wang Z，Zhang X，Wang H，et al.Neuroprotective effects of icariin against b te a amyloid－induced neurotoxicity in primary cultured rat neuronal cells via estrogendependent Pathway.Neuroscience，2007，145（3）：911－922.

11 Brazil DP，Hemmings BA.Ten years of protein kinase B signalling：a hard Akt to follow.Trends Biochem Sci，2001，26（10）：657－664.

12 Sakamoto K，Karelina K，Obrietan K.CREB：a multifaceted regulator of neuronal plasticity and protection.J Neurochem，2011，116（1）：1－9.

13 Peltier J，O＇Neill A，Schaffer DV.PI3K／Akt and CREB regulate adult neural hippocampal progenitor proliferation and differntiation.Dev Neurobiol，2007，67（10）：1348－1361.

14 Ji Y，Pang P T，Feng L，et al.Cyclic AMP controls BDNF－induced TrkB phosphorylation and dendritic spine formation in mature hippocampal neurons.Nat Neurosci，2005，8（2）：164－172.

15 Li M，Dai F R，Du XP，et al.Infusion of BDNF into the nucleus accumbens of agede rats improves cognition and structural synaptic plasticity through PI3K－ILK－Akt signaling.Behav Brain Res，2012，231（1）：146－153.