化妆品中金黄色葡萄球菌焦磷酸测序检测方法的研究

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(1. 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心,山东青岛 266002; 2. 黄岛出入境检验检疫局,山东青岛 266555)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一种具有较强抵抗力的人兽共患病原菌,可导致各种疾病和引起皮肤或器官的多种化脓性感染(故它又名为化脓性葡萄球菌),严重时可导致败血症。我国化妆品卫生标准中规定:在化妆品中不得检出金黄色葡萄球菌[1]。国内外膏霜类化妆品中曾检出此种细菌,因此,在化妆品中检测葡萄球菌具有重要的卫生意义。

目前我国检测化妆品中金黄色葡萄球菌主要采用细菌常规分离培养方法,耗时长[2],需3 ～ 5d,且检测灵敏度较低,易导致漏检。采用免疫学检测方法如乳胶凝集实验和酶联免疫吸附法(ELISA,enzyme -link immunosorbenr assay),虽可缩短检测时间,但工作原理是抗原抗体的中和反应,因此会受到样品成分及葡萄球菌A蛋白的影响,假阳性高。

焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是近年来发明的一项快速、准确、实时地进行短片段DNA测序技术,目前该技术正广泛应用于微生物的鉴定[3 - 4]。本研究选取金黄色葡萄球菌保守的nuc基因,以焦磷酸测序法对扩增片段进行准确测序,进行基因序列同源性比对,建立准确检测化妆品中金黄色葡萄球菌的焦磷酸测序法。

1 材料与方法

1. 1 材料与仪器

实验菌株如表1所示。

表1 实验用菌株明细表Table 1 The part list of test strains

SCDLP液体培养基、Baird - Parker平板、血琼脂培养基、甘露醇发酵培养基 陆桥公司;PCR扩增引物:上游引物5′ - GGATGGCTATCAGTAATGTTTCG -3′;下游引物5′ - TTAACCGTATCACCATCAATCG - 3′,5′端标记生物素、焦磷酸测序引物:5′ - GATTCAA CAGTATATAGTGC - 3′、GelRed染色液、细菌DNA提取试剂盒、2×GoTaq Master Mix体系 金斯瑞;电泳缓冲液(1×TAE);琼脂糖(分析纯);6×上样缓冲液:30mmol/L EDTA、36%(体积分数)甘油、0. 05%(质量浓度)二甲苯腈蓝FF、0. 05%(质量浓度)溴酚蓝;无菌去离子水;焦磷酸测序试剂盒:包括焦磷酸测序用酶、底物及各种dNTP、链酶亲和素磁珠(Sepharose beads)、绑定缓冲液(Binding Buffer)、复性缓冲液(Annealing Buffer)、变性缓冲液(Denaturation Buffer)、洗液(Washing Buffer);焦磷酸测序仪96孔测序板;微量可调移液器吸头。

购买的市售化妆品作为检测验证材料:妮维雅润肤霜、wetcode洁面泡泡、相宜本草润肤霜、Biore洁面泡沫、卡尼尔嫩白洁面乳、东洋之花补水丝滑乳液、李医生亮肤水、相宜本草红景天幼白精华水、兰皙高水分乳霜、大宝洗面奶。

5331普通PCR仪 Eppendorf;Centrifuge 5415D离心机 Eppendorf,离心速度12000 r/min以上;PyroMark ID检测系统 瑞典Biotage公司。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 实验菌株的准备 实验菌株均使用细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA,存放于 - 20℃,以备PCR特异性扩增和焦磷酸测序验证用。

1. 2. 2 标准菌株验证 提取金黄色葡萄球菌和其它非金黄色葡萄球菌细菌基因组DNA进行PCR反应,50μL PCR反应体系:10×PCR buffer 5μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL)0. 5μL,上下游扩增引物(20μmol/L)各0. 5μL,dNTPs(10mmol/L)1μL,模板DNA 0. 5μL,双蒸水补足体积至50μL。

PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃变性20s,58℃退火30s,72℃延伸20s,40个循环;72℃延伸5min;4℃保温。

PCR扩增产物用1. 5%琼脂糖凝胶(55 ～ 60℃时加入万分之一GelRed染色液)。取5 ～ 8μL PCR扩增产物,分别与1μL上样缓冲液混合进行点样,用DNA分子量标记物做参照。3 ～ 5V/cm恒压电泳20 ～40min,电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存(图1)。结果表明,能够扩增到金黄色葡萄球菌特异性片断,而其他非金黄色葡萄球菌无特异性片断。

1. 2. 3 样品制备和增菌 参照GB 7918. 1和GB 7918. 5进行样品的制备和增菌。

1. 2. 4 可疑菌株分离 应用Baird Parker氏培养基或血琼脂平板,参照GB 7918. 5进行金黄色葡萄球菌的分离。

1. 2. 5 PCR扩增 参考文献[5 - 6]。

1. 2. 5. 1 模板DNA提取 挑取1. 2. 3的增菌液或1. 2. 4可疑分离菌株,按照细菌DNA提取试剂盒说明提取细菌基因组DNA备用(不能及时检验,则放置于 - 20±1℃冰箱保存备用)。

1. 2. 5. 2 PCR扩增 取0. 5μL 1. 2. 5. 1提取的DNA模板,加入10×PCR缓冲液5μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0. 25μL,20pmol/μL 上下游引物各0. 5μL,DEPC处理水补足体积至50μL。PCR扩增分别设阳性对照、阴性对照和空白对照,扩增产物长度为247bp。

PCR扩增参数:94℃预变性5min,94℃变性20s,58℃退火30s,72℃延伸20s,50个循环,72℃延伸5min,4 ℃保温。

PCR产物用1. 5%琼脂糖凝胶(55 ～ 60℃时加入万分之一的GelRed核酸染色剂)进行电泳检测,3 ～ 5V/cm恒压电泳20 ～ 40min,电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录保存。

1. 2. 6 焦磷酸测序 参考文献[7 - 9]。

1. 2. 6. 1 测序单链模板的制备 将50μL PCR产物转移至96孔测序板中,在产物中分别加入磁珠3μL和绑定缓冲液47μL,常温混匀10min。

打开真空泵,将真空吸附器在超纯水中清洗30s后移到96孔测序板中,抓取与磁珠结合后的PCR产物,分别在70%乙醇中清洗5 ～ 10s、变性缓冲液中变性5s、洗涤缓冲液中清洗5 ～ 10s。关闭真空泵,将磁珠释放入96孔测序板中,该板中预先加入1μL 20pmol/μL测序引物和44μL退火缓冲液。

将96孔测序板置80℃烘箱2min后,取出冷却至室温进行焦磷酸测序反应。

1. 2. 6. 2 焦磷酸测序反应 设定测序程序,碱基的加入为ATCG 6 ～ 10个重复,根据程序给定剂量(该剂量根据样本数的多少而定,由仪器程序自动给出),在试剂舱中加入酶混合物、底物混合物以及四种dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP),将试剂舱和96孔测序板放入机箱中进行反应。

测序反应在28±1℃下于焦磷酸测序仪上进行,加样使用600mbar/8msec的加样压力和时间,每轮反应时间65s。引物链随着不同dNTP的加入而延伸。随着核酸的结合,CCD摄像机检测到发出的光信号,读出DNA序列。

1. 2. 6. 3 结果判定 测序目标序列为:AACTTCAACTAAAAAATTAC。焦磷酸测序结果或与测序结果目标序列不一致,则判断为阴性。焦磷酸测序结果与目标序列完全一致,则判断为阳性。

1. 2. 6. 4 杂菌干扰实验 分别吸取1mL 10个/mL的金黄色葡萄球菌ATCC6538、表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、奇异变形杆菌增菌液至90mL SCDLP中增菌16 ～ 18h进行干扰实验,各吸取1mL 10个/mL表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、奇异变形杆菌增菌液至90mL SCDLP增菌做阴性对照。吸取1mL培养液,提取基因组DNA,进行PCR和焦磷酸测序测试。

2 结果与分析

2. 1 标准菌株验证

对金黄色葡萄球菌阳性和标准菌株PCR扩增产物进行电泳检测,结果表明PCR体系能扩增到金黄色葡萄球菌特异性片断,而其他非金黄色葡萄球菌无特异性片断(图1)。

图1 PCR扩增结果Fig. 1 The results of PCRs注:各条带从左向右依次为DL500、金黄色葡萄球菌:J - 1、J - 2、J - 3、J - 4、J - 5、ATCC6538、表皮葡萄球菌GIMT1. 126、巴氏葡萄球菌GIMT1. 058、单核细胞增生李斯特氏菌ATCC 7644、DL500。

2. 2 特异性和重现性验证实验

提取39株金黄色葡萄球菌以及30株非金黄色葡萄球菌的基因组DNA,按照上述PCR检测步骤进行特异性实验,结果如图2所示,扩增引物针对金黄色葡萄球菌的特异性、灵敏度、重现性良好,其他菌株DNA没有扩增出目的条带。

2. 3 杂菌干扰实验

杂菌干扰结果表明,PCR引物能够有效去除杂菌干扰,能够有效扩增出目的片段(图3)。

2. 4 利用化妆品进行方法验证

通过添加不同浓度的金黄色葡萄球菌至化妆品中,根据GB 7918. 1和7918. 5进行样品的制备和增菌,对增菌液进行PCR扩增并进行焦磷酸测序,结果表明,添加浓度10个/g(mL)(因样品的质地不同,单位不一样,润肤霜用克计量,亮肤水用mL计量)以上的增菌液,皆能扩增出目的条带,添加浓度为1个/g(mL)只有部分能够扩增出来目的条带,和常规分离结果一致;并且只要PCR为阳性的样品,焦磷酸测序结果也为阳性(表2)。

表2 化妆品添加金黄色葡萄球菌方法验证结果Table 2 Method validation results in cosmetics added with S. aureus

图2 金黄色葡萄球菌和非金黄色葡萄球菌PCR扩增结果Fig. 2 PCR amplification results of S. aureaus and other bacteria strain

图3 杂菌干扰实验结果Fig. 3 Bacterial interference results注:从左到右依次为分子标准DL500、添加干扰菌(干扰菌为表皮葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、奇异变形杆菌)、纯干扰菌、阳性对照ATCC6538、空白。

注:括号外结果为PCR结果,括号内结果为焦磷酸测序结果。

2. 5 焦磷测序结果

对上述扩增结果为阳性和阴性的PCR产物进行焦磷酸测序,实验结果表明(表2和图4):只有PCR结果为阳性的样品测序结果为阳性,其测序结果皆为AACTTCAACTAAAAAATTAC,可确定样品中检出金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、添加干扰菌实验、灵敏度实验样品(相宜本草红景天幼白精华水1个/mL添加样品、卡尼尔嫩白洁面乳10个/g添加样品)进行焦磷酸测序结果表明,能够快速对可疑金黄色葡萄球菌进行测序结果判定。

图4 部分焦磷酸测序结果Fig. 4 A part of pyrosequencing results

3 结论和讨论

病菌检测的传统方法为生化培养法,但随着各种化妆品安全问题的不断发生,生化培养的时间问题严重影响了检测进程和结果判定,因此各种快速检测技术不断涌现,免疫学法、测试片法、PCR方法、LAMP技术等等[9],但这些快检技术都存在着自身的不足之处,如,免疫学方法假阴性高,人为要求操作水平影响较大[10 - 11;测试片储存时间极短,一旦开封剩余测试片储存时间最多两个月,且不易保存;PCR 方法存在气溶胶污染;LAMP方法,易出现假阴性、假阳性的结果,且结果不易稳定,因此,测序技术是目前相关技术中最本质的从基因序列水平判读结果的方法,可靠性大大增强。

本研究采用PCR扩增和焦磷酸测序相结合的方法,通过采用特异的测序引物对金黄色葡萄球菌保守基因nuc基因进行焦磷酸测序,从而建立化妆品中金黄色葡萄球菌的焦磷酸测序检测方法,结果表明,测序结果皆为AACTTCAACTAAAAAATTAC,能快速(4h以内)可靠地鉴定鉴别金黄色葡萄球菌。焦磷酸测序检测金黄色葡萄球菌的方法吸收了PCR和DNA测序技术两方面的优势,在PCR特异性的基础上,应用很短的一段保守/特异序列的测定就可满足对分子诊断的需要。

本方法建立的焦磷酸测序体系能够非常准确地对nuc基因进行测序,以此序列对金黄色葡萄球菌进行快速鉴定,提高了检测的特异性和效率,给出了分子诊断的黄金标准 - 基因序列,减少了由于PCR敏感性高而出现的假阳性结果,提高了检测的准确性,可以对目标生物实现快速、实时、高通量、准确鉴定[4]。

[1]GB 7916 - 1987 化妆品卫生标准[S].

[2]GB 7918. 5 - 1987 化妆品微生物标准检验方法 金黄色葡萄球菌[S].

[3]李秀娟,徐保红,宋红梅,等. 沙门菌PCR - 焦磷酸测序法检测[J]. 中国公共卫生,2009,25(8):997 - 998.

[4]李秀娟,徐保红,田会方,等. 焦磷酸测序法检测单增李斯特菌[J]. 中国卫生检验杂志,2010,20(7):1623 - 1625.

[5]赵新,王永,兰青阔,等. 焦磷酸测序技术在4种食源性致病菌快速检测中的应用[J]. 食品与生物技术学报,2013,32(2):132 - 138.

[6]徐晓可,吴清平. 食品中金黄色葡萄球菌多重PCR检测方法的研究[J]. 食品与生物技术学报,2010,30(1):84 - 89.

[7]陈之遥,周国华. 焦测序技术的研究进展[J]. 现代生物医学进展,2008,8(8):1573 - 1598.

[8]Wu H P,Wu W J,Chen Z Y,etal. Gene expression analysis on a photodiode array - based bioluminescence analyzer by using sensitivity - improved SRPP. [J]. Analytical Chemistry,2011,83(9):3600 - 3605.

[9]Ronaghi M,Uhlen M,Nyren P. A sequencing method based on real - time pyrophosphate[J]. Science,1998,281(5375):363 - 365.

[10]Ramaswamy S,Musser J M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobarterium tuberculosis:1998 update[J]. Tubercle and Lung Disease,1998,79:3 - 29.

[11]Ronaghi M,Karamohamed S,Pettersson B,etal. Real - time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release[J]. Analytical Biochemistry,1996,242:84 - 89.