蛋白质标准物质的制备概况

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(1. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047; 2. 南昌大学中德联合研究院,江西南昌 330047; 3. 江西中医药大学护理学院,江西南昌 330004; 4. 温州大学生命与环境科学学院,浙江温州 325035)

蛋白质是一类重要的生物分子,其标准物质是建立蛋白质量值溯源传递体系,实现蛋白质计量的重要器具。研究发现,蛋白质可作为健康或疾病的标志物,常用于商业分析[1 - 2]。例如,测量的蛋白质血清心肌肌钙蛋白I已成为心肌梗死(心脏病发作)的临床诊断“金标准”。这些测量的准确度是否可靠是临床诊断的依据,不同的临床实验制造商采用不同的校准器和不同的特异性抗体,因此这些商业分析系统给出的结果,可比性较差。只有按标准测量程序参照标准物质定量的结果,才能使临床检测和诊断实现标准化。

食物的成分准确分析,也有赖于标准物质的应用。以过敏原蛋白为例,食物过敏研究的数据显示,制备过敏原蛋白质标准物质用于安全检测是非常必要的[3]。若未采用标准物质,不同的检测结果可能有数倍以至几十倍的差异[4 - 5],结论难以令人信服。为了实现实验结果的可比性、准确性和可溯源性[6],标准物质的使用是必须条件。

蛋白质标准物质在临床医学和食品卫生领域有着重要地位,包括用于肿瘤细胞的检测[7]、糖尿病诊断[8]、药物筛选、抗体检测[9]、转基因食品、食物过敏[10]和食品添加剂的检测等。随着蛋白质疾病、肿瘤标志物在临床检验中的应用,蛋白质功能食品的兴起,以及对食物过敏等食品安全问题的重视,市场将有更多的蛋白质标准物质需求。蛋白质标准物质是蛋白质检测,尤其是定量分析中使用的实物标准。作为计量学上的计量器具之一,标准物质一直是国内外标准化组织研究的重要内容,其制备和使用直接影响到蛋白质检测数据的可靠性和有效性。但因受到实验室技术装备、蛋白质自身性质和计量溯源性等条件的制约,蛋白质标准物质难以标准化生产,现有蛋白质标准物质的种类相对较少。未来蛋白质标准物质的制备应结合蛋白质计量的需求以及蛋白质计量技术的发展方向,提高蛋白质标准物质的质量,增加供应种类[11]。

1 标准物质和有证标准物质

1. 1 标准物质(Reference Material)

标准物质是具有一种或多种足够均匀和良好确定特性,用以校准测量设备、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质[12 - 13]。定义中的“特性”是包括标准物质的化学成分、物理性质、工程参数等[14 - 15]。

1. 2 有证标准物质(Certified Reference Material)

有证标准物质是附有认定证书的标准物质,其一种或多种特性量值用建立了溯源性的程序确定,使之可溯源到准确复现的表示该特性值的测量单位。每一种认定的特性量值都附有给定置信水平的不确定度。

2 蛋白质标准物质的制备与表征

2. 1 标准物质的制备和质量控制

标准物质的制备和表征应按照ISO导则[16 - 18]、2000年版《中国生物制品规程》和《一级标准物质技术规范》[19]的要求进行制备。制备蛋白质标准物质,首先蛋白质纯化所采用的方法应是常规、简单和公认的。纯化蛋白质的一般步骤为:蛋白质的粗提取,对目标蛋白质进行分馏、浓缩和稳定化,去杂质,后期纯化[20 - 21]。理想的蛋白质分离提纯方法,需要在保持蛋白质生物活性的前提下,达到蛋白质标准物质的纯度要求。

标准物质初步检查主要包括:外观初步检查,蛋白质标准物质可以是固体粉末状颗粒,也可以是溶液状态；理化特性表征,包括吸水性、pH等；另外还需对蛋白质进行无菌检查、纯度及杂质检查。检查结果符合各方面的要求后,方能进行分装和包装。

2. 2 蛋白质标准物质的结构表征及常用的蛋白质数据库

国际物质量咨询委员会(CCQM)于2001年确定的蛋白质计量研究内容包括蛋白质定量、相对分子质量、蛋白质功能、生物学活性[22]以及蛋白质的高级结构等[23]。蛋白质鉴定的第一步往往就是测定其分子量,分子量的正确与否预示着该多肽或蛋白质的一级结构是否正确。质谱技术(Mass Spectrometry,MS)[24]为快速准确地获取蛋白质的一级结构信息提供了权威的检测技术手段。圆二色光谱(CD)可以用来定量估计蛋白质在溶液状态下的各种二级结构(如α - 螺旋,β - 折叠,β - 转角和无规卷曲)。

蛋白质标准物质的结构表征离不开蛋白质数据库,常用的蛋白质数据库有:PDB、ISSD、HSSP、SCOP等。

蛋白质的基本立体结构数据库为PDB(Protein Data Bank),1971年建立于美国布鲁海克海文国家实验室。该数据库中收集了通过X射线衍射和核磁共振(NMR)实验测定的蛋白质结构的精确坐标数据。这种数据即蛋白质中的原子坐标是蛋白质结构的最细致的层次。该数据库的管理者是结构生物信息学合作研究组织(Research Collaboration for Structural Bioinformatics,RCSB)。

ISSD蛋白质数据库,其每个条目包含一个基因的编码序列,同相应的氨基酸序列对比,并给出相应多肽链的结构数据。核苷酸序列取自GenBank,结构参数来自PDB,包括多肽骨架原子坐标,二面角,还有DSSP程序所预测的二级结构。

HSSP是根据同源性导出的蛋白质二级结构数据库。每一条PDB项目都有一个对应的HSSP文件。该数据库同时提供了SWISS - PROT数据库中所有蛋白质序列的同源性。

蛋白质结构分类数据库(structural classification of proteins,SCOP)是对已知的蛋白质三维结构进行手动分类得到的数据库,将已知结构蛋白质进行有层次地分类。该资源允许用户分析查询蛋白质是否和已知结构蛋白质具有相似性。

2. 3 蛋白质标准物质的延续性

蛋白质标准物质的延续性是指标准物质在一定范围内,能够在不同时间、空间用于检测分析和统一量值。蛋白质标准物质是一种消耗性物质,因此必须保证标准物质的制备是可以延续的,即标准物质必须有足够的批量,且能够迅速地再生产获得。

2. 4 新技术的应用

一般而言,蛋白质稳定性的主要影响因素包括二硫键、氢键和盐桥等,而这往往也是提高蛋白质稳定性的着力点。提高蛋白质的稳定性,可考虑降低折叠与非折叠的熵差,减少非折叠的构象,还可通过稳定α螺旋和填充疏水内核,使蛋白质构象处于能量最低状态和最稳定状态[25]。蛋白质工程技术[26]通过对蛋白质进行修饰,改造和拼接以生产出能满足标准物质制备要求的蛋白质。另外,通过基因工程菌的重组和表达[27],可扩大蛋白质标准物质的制备规模,满足蛋白质检测分析的计量需求。

3 均匀性检验和稳定性评价

3. 1 均匀性检验

均匀性检验按照《一级标准物质技术规范》[19]的要求,确定抽样方法、抽取单元数和最小取样量[28],测量取自不同包装单元(如:瓶、包等)或同一包装单元以及特定大小的样品。影响蛋白质标准物质均匀性的因素有:纯度、分装精度及其自身的化学形态和结构状况,并保证均匀性检验实验条件的一致性。

数据统计分析按照ISO导则35(2006版)[18]的要求,检查蛋白质标准物质的检测结果。通过均匀性检验结果,一方面说明特性值在各个部位之间是否均匀；另一方面要测定标准样品的特性值在不同部位之间不均匀的程度,即确定不确定度,并说明可能的变化来源,进而判断不均匀性程度是否可以接受。若测量结果落在规定不确定度范围内,则可认为标准物质所指定的特性是均匀的[29],为考查蛋白质标准物质的稳定性做好准备。

3. 2 稳定性评价

标准物质的稳定性,是指在规定的储存和使用条件下,在规定的时间间隔内,其特性量值在规定的范围内保持不变的能力,是标准物质的基本性质之一。标准物质的稳定性考察及评价应真实地反映出该标准物质稳定性能,使标准物质能在有效期内发挥其量值传递的作用。

3. 2. 1 稳定性评价的方法 稳定性的检测有影响因素实验、加速实验[22]和长期实验。稳定性检验的测试方法应是精密和灵敏的,并且具有很好的重现性。对于新研制的标准物质,随机取一最小单元,从新研制完成开始,测定其标准物质特性量值随时间变化的情况,此最小单元在考察的时间间隔按此标准物质的存放条件保存,以确保稳定性实验的有效性和准确性。评价标准物质的稳定性有t检验法和平均值一致性检验法[30],以统计分析标准物质的特性值是否发生显著性变化。

3. 2. 2 影响蛋白质标准物质稳定性的因素 影响稳定性的因素主要有:光、温度和湿度等物理因素；溶解、分解和化合等化学因素及细菌作用等生物因素。由于蛋白质不稳定,容易降解,可能需要避光低温贮藏。此外,残留水分含量也有可能影响标准物质的稳定性[31]。考察分析蛋白质标准物质在环境因素影响下的变化规律,可以为蛋白质标准物质的生产、包装、贮藏、运输条件提供科学依据[32 - 33]。

4 蛋白质标准物质的定值及不确定度的评定

蛋白质标准物质定值是采用技术上正确的方法进行测定,确定蛋白质标准物质的特性值,并由测定不确定度组成。

4. 1 定值方式

标准物质特性值的测定有几种技术上有效的方式。按定值内容来选择测量方法及具体测量方案(即采用单个实验室、一种权威的测量方法或是采用多个实验室合作研究)[34]。具体选择哪一种方法应根据标准物质的类型、最终使用需求、实验室所具备的资质和所用方法的质量水平来评估特性值的不确定度。WHO生物制品标准化专家委员会通常采用国际间实验室联合定值的方法[35 - 36]。

根据《一级标准物质技术规范》和ISO导则35,定值分析要求每个实验室至少提供一个最小单元(瓶)特性量值的测定结果,每瓶样品至少提供2个以上特性值的重复测量数据,测量数据都保留4位有效数字。定值分析所使用的样品瓶号是随机抽取的。

4. 2 定值范围

准确检测蛋白含量是实现标准物质溯源传递的基础,其测定按照2005年版中国药典三部方法进行[37]。对于纯蛋白质,常规的蛋白质含量测定方法包括氨基酸分析、定氮法以及纯度扣除法等,目前国际公认的权威方法包括精密库仑法、同位素稀释质谱法、重量法、容量法、凝固点下降法等[38]。此外,免疫技术也应用于蛋白质的定性和定量[39]。

4. 3 与国际标准物质的比较

研制标准物质与国际标准物质的谱图相同,国际标准物质经稀释后,两者的谱图几乎重合,说明两种标准物质所含的物质相同；用本研究的定值方法对国际标准物质进行测定,定值结果与国际标准物质的定值相对比无显著差异,则说明标准物质的定值方法准确、可靠。

4. 4 定值结果的统计处理

蛋白质检测结果不确定度的评定依照JJF1059 - 1999《测量不确定度评定与表示》[40]。定值数据分析首先经Dixon检验、Gmbbs检验判断有无离群值,经相应处理后,并根据不确定度公式计算出定值的不确定度[41]。

标准物质的特性量值具有准确计量的或严格定义的认定值,认定值与真值的偏离程度不超过计量方法的不确定度。当用计量方法确定认定值时,认定值就是被测定特性量值之真值的最佳估计值,认定值与真值的偏离程度不超过计量方法的不确定度。

通常标准物质证书中都要给出认定值及其不确定度。认定值总不确定度的分析(即定值分析数据平均值的平均值)的总不确定度来源由3部分组成:一是通过测量数据的标准偏差、测量次数及所要求的置信概率按统计方法计算得出,并对测量的其它一些影响因素作出分析估算出其大小；二是物质的均匀性引起的不确定度的估计；三是物质在有效期内稳定性发生变动引起的不确定度分量。

4. 5 蛋白质标准物质不确定度的评定

根据ISO导则35,标准物质特性量值的不确定度评定[42]主要包括四个部分:方法定值的不确定度；标准物质瓶间不均匀性产生的不确定度；标准物质特性量值的长期稳定性所引起的不确定度；标准物质特性量值的短期稳定性所引起的不确定度。

利用ISO导则35所给出的公式计算标准物质定值的标准不确定度,将标准不确定度乘以包含因子,计算得到定值结果的扩展不确定度,根据其与真值的接近程度判断是否达到标准物质的测量需求。

5 结语

国内外众多标准化组织及计量科学工作者正致力于蛋白质标准物质的研究,并把蛋白质标准物质作为计量工具的完善和补充。蛋白质标准物质的制备,需要建立起系统的蛋白质标准物质制备流程及方法,严格执行质量控制,采用权威方法联合多家实验室定值。蛋白质标准物质可应用于临床检验、生物医药、食品安全等领域,为蛋白质的分析检测提供可靠的量值溯源保证,应用前景十分广阔。

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