RNA干扰 HDAC1对人宫颈癌SiHa细胞迁移及侵袭影响

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(中国人民武装警察部队后勤学院附属医院妇产科，天津 300162)

恶性肿瘤的发生是一个多基因改变的复杂过程，涉及抑癌基因的失活及癌基因的激活，癌基因及抑癌基因表达变化既有遗传学机制，也有表观遗传学机制。研究显示，组蛋白乙酰化是肿瘤相关基因最常见的表观遗传学调控形式之一[1]。组蛋白乙酰化的失衡，特别是乙酰化的降低，可影响细胞的增殖和凋亡，导致肿瘤的发生。组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)共同调节组蛋白乙酰化水平。其中HDAC有四大类18个亚型，目前研究多集中在HDAC1。本研究旨在观察RNA干扰(RNAi)技术抑制HDAC1基因表达对宫颈癌SiHa细胞迁移和侵袭的影响，并且探讨其可能的作用机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1材料

人宫颈鳞癌来源的SiHa细胞系购于武汉典型生物保藏中心，本科实验室储存；RPMI 1640培养液购自Gibco公司，Trizol和Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，SYBR Green Real-time PCR Master Mix购自TaKaRa 公司，HDAC1、乙酰化组蛋白H4(Ac-H4)和β-actin单克隆抗体购自Santa Cruz公司，Transwell小室购自Corning公司，Matrigel基质胶购于BD公司，小干扰RNA(siRNA)链及寡核苷酸引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及转染 SiHa细胞置于含胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37 ℃、体积分数0.05 CO2、饱和湿度条件下培养。HDAC1基因siRNA序列：正义链5′-GCCGGUCAUGUCCAAAGUAT-T-3′，反义链5′-UACUUUGGACAUGACCGGCT-T-3′；阴性对照siRNA序列：正义链5′-UUCUC-CGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链5′-ACGUG-ACACGUUCGGAGAATT-3′。细胞按每孔106个接种于6孔板，贴壁生长24 h后转染。转染前1 h吸净含血清的培养液，换成不含血清的培养液，具体转染步骤参照Invitrogen公司操作手册。转染6 h后更换成含胎牛血清的完全培养液，转染48 h后收集细胞进行实验。实验分为正常对照组(无干预措施)、阴性对照组(转染阴性对照siRNA)和siRNA干扰组(转染HDAC1基因siRNA)。

1.2.2荧光定量 PCR Trizol一步法抽提细胞总RNA，紫外线分光光度仪测定A260/A280值，以检测RNA样品的纯度和浓度。以Randam Primer为引物合成cDNA，42 ℃ 15 min，70 ℃ 5 min，产物-20 ℃保存。采用7700全定量PCR仪，以GAPDH为内参照进行PCR。各基因引物序列见表1。反应条件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共40个循环。计算目的基因相对表达量(RQ值)，实验重复3次,取平均值。

表1 定量PCR基因引物序列

1.2.3Western blot检测 收集细胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解10 min，弃沉淀。应用BCA试剂盒进行蛋白定量，按照试剂说明书操作。取20 μg总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移蛋白至硝酸纤维素膜上，采用50 g/L脱脂奶封闭，加封闭液稀释的一抗(1∶500)，4 ℃孵育过夜，洗膜后与辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)室温下孵育1 h，洗膜3次，ECL发光压片成像，以β-actin为内参照，条带用Quantity One软件转化为灰度值，以目的条带/β-actin条带灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。实验重复3次,取平均值。

1.2.4划痕实验 取各组细胞接种于6孔板中，当细胞融合度达95%时，用小移液器滴头划痕，PBS洗3次。改用无血清的RPMI 1640培养液继续培养24 h，镜下观察并记录划痕距离，通过测量多个点划痕宽度，计算平均划痕愈合率。划痕愈合率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次,取平均值。

1.2.5Transwell侵袭实验 收集各组细胞，Transwell小室底部膜的上室面包被一层Matrigel基质胶，上室加入5×104个细胞，稀释于200 μL 不含血清的RPMI 1640培养液中，下室加入600 μL 含血清的RPMI 1640培养液，置于37 ℃、体积分数0.05 CO2、饱和湿度条件下培养24 h。取出膜，用棉签拭净基质胶及上室面细胞，甲醛固定，结晶紫染色后，镜下计数穿过透到膜背面细胞数，随机选择3个不同视野计数，实验重复3次,取平均值。

1.3统计学方法

2 结 果

2.1HDAC1 siRNA对宫颈癌SiHa细胞HDAC1基因表达的影响

siRNA干扰组与正常对照组和阴性对照组相比，HDAC1蛋白和mRNA表达降低，差异有统计学意义(F=549.99、19.02,P<0.05)；正常对照组与阴性对照组HDAC1蛋白和mRNA表达相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表2。

2.2HDAC1 siRNA对宫颈癌SiHa细胞Ac-H4表达的影响

siRNA干扰组与正常对照组和阴性对照组相比，Ac-H4蛋白表达增加，差异有显著性(F=17.41，P<0.05)；正常对照组与阴性对照组Ac-H4蛋白表达相比，差异无显著性(P>0.05)。见图1、表2。

A：正常对照组；B：阴性对照组；C：siRNA干扰组。

图1SiHa细胞HDAC1和Ac-H4蛋白的Westernblot检测

HDAC1 mRNAHDAC1Ac-H410.21±0.310.81±0.120.76±0.189.89±0.430.79±0.140.75±0.17siRNA4.99±0.320.42±0.150.32±0.16

2.3HDAC1 siRNA对宫颈癌SiHa细胞迁移能力的影响

siRNA干扰组与正常对照组和阴性对照组相比，细胞划痕愈合率降低，差异有统计学意义(F=47.00，P<0.05)；正常对照组与阴性对照组细胞划痕愈合率相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表3。

2.4HDAC1 siRNA对宫颈癌SiHa细胞侵袭能力的影响

siRNA干扰组与正常对照组和阴性对照组相比，穿透Transwell滤膜的细胞数量降低，差异有统计学意义(F=181.43，P<0.05)；正常对照组与阴性对照组穿透Transwell滤膜的细胞数量相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表3。

2.5HDAC1 siRNA对宫颈癌SiHa细胞核因子-κB(NF-κB)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)基因mRNA表达的影响 与两对照组相比，siRNA干扰组NF-κB和uPA基因mRNA表达降低，差异有统计学意义(F=39.33、34.10，P<0.05)；两对照组NF-κB和uPA基因mRNA表达相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

(χ/%)()NF-κB mRNAuPA mRNA62.40±5.3182.44±6.196.72±0.755.67±0.7659.58±5.0080.22±4.526.82±0.715.85±0.73siRNA40.43±4.7340.67±4.854.12±0.743.24±0.65

A～C为宫颈癌细胞划痕实验，D～F为宫颈癌细胞侵袭实验。A、D：正常对照组；B、E：阴性对照组；C、F：siRNA干扰组。

3 讨 论

宫颈癌是女性常见的生殖道恶性肿瘤，其临床特点是直接侵犯邻近组织和盆腔淋巴结远处转移。宫颈癌局部浸润是指肿瘤细胞沿组织间隙直接向宫颈或宫体外扩展，宫颈局部广泛浸润时，可形成冰冻骨盆。宫颈癌早期即可发生远处淋巴结的转移，有研究显示，无淋巴结转移者5年生存率可达82.3%，而有淋巴结转移者5年生存率只有50.8%，故淋巴结转移是判断宫颈癌预后的一个独立因素[2]。因此，早期阻断宫颈癌浸润和转移对宫颈癌的临床治疗具有重要意义。近年来在对宫颈癌发生及侵袭转移的研究中，组蛋白乙酰化调节作为表观遗传学中重要的基因表达调控方式之一赿来赿受到重视。

真核生物核小体中的组蛋白乙酰化是由HAT和HDAC共同调控。组蛋白的乙酰化多发生在组蛋白N端碱性氨基酸中特定赖氨酸残基上，HAT将乙酰辅酶A的乙酰基转移到赖氨酸的氨基端，中和组蛋白所带的正电荷，从而减弱DNA和组蛋白的相互作用，使转录因子易与DNA结合而促进转录；HDAC则可以移去氨基端的乙酰基，增强DNA和组蛋白的相互作用，从而抑制转录。HDAC是一类具有能通过组蛋白转录后修饰来调节基因转录或调节其他转录因子的酶，有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ等4型，其中Ⅰ型包括HDAC1、2、3、8[3]。研究显示，HDAC1在宫颈癌组织中高表达，并与高危型HPV感染关系密切[4-5]，HDAC1 siRNA在肺腺癌A549细胞、胰腺癌PaTu8988细胞、宫颈癌HeLa细胞中能抑制细胞生长[6-8]。本文用siRNA沉默宫颈癌SiHa细胞HDAC1，结果显示，转染HDAC1 siRNA的SiHa细胞HDAC1在mRNA和蛋白水平上明显降低，说明我们体外构建的HDAC1 siRNA能有效下调SiHa细胞HDAC1基因表达。HDAC1基因表达下调后，SiHa细胞迁移能力下降，侵袭能力也降低，说明HDAC1基因在宫颈癌侵袭转移中发挥重要作用。

肿瘤的侵袭和转移是肿瘤细胞、宿主细胞及细胞外基质之间相互作用的结果。参与肿瘤侵袭的分子机制很多，与宫颈癌侵袭转移关系密切的主要包括整合素家族、uPA系统、金属蛋白酶系统、血管内皮生长因子及其特异性受体等相关基因[9]。细胞外基质和基底膜降解是肿瘤细胞侵袭转移的必要条件，uPA在此环节中扮演重要角色。uPA是肿瘤细胞本身分泌的一种丝氨酸蛋白水解酶，可激活前基质金属蛋白酶3，从而激活前基质金属蛋白酶9，并促进胶原纤维的降解[10]。NF-κB是细胞转录因子，活化的NF-κB信号通路可促进肿瘤细胞增殖、迁移，增加其对化疗药物的抵抗性。NF-κB可以调控凋亡相关基因、原癌基因、肿瘤相关黏附分子基因的表达，这些基因与肿瘤的发生、转化、侵袭和转移密切相关。其中uPA是依赖于NF-κB通路调节转录过程的下游基因之一[11]。NF-κB和uPA基因在宫颈癌组织中高表达，与宫颈癌细胞侵袭和转移关系密切[12]。本文的研究结果显示，HDAC1基因表达下调后，SiHa细胞Ac-H4的表达增加，同时细胞NF-κB基因和uPA基因mRNA表达则降低。说明HDAC1 siRNA下调SiHa细胞HDAC1基因表达，增加组蛋白乙酰化水平，可抑制NF-κB和uPA基因表达。结果表明，NF-κB和uPA基因表达下降可能是HDAC1 siRNA抑制宫颈癌SiHa细胞迁移和侵袭的机制之一。

综上所述，HDAC1基因在宫颈癌侵袭转移中发挥重要作用，抑制HDAC1基因表达有望成为宫颈癌新的治疗途径。

[参考文献]

[1]LIU S. Epigenetices advancing personalized nanomedicine in cancer therapy[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2012,64(13):1532-1543.

[2]LI D, CAI J, KUANG Y, et al. Surgical-pathologic risk factors of pelvic lymph node metastasis in stage Ⅰb1-Ⅱb cervical cancer[J]. Acta Obstet Gynecol Scand, 2012,91(7):802-809.

[3]HAGELKRUYS A, SAWICKA A, RENNMAYR M, et al. The biology of HDAC in cancer; the nuclear and epigenetic components[J]. Handb Exp Pharmacol, 2011,206:13-37.

[4]邢军,岳天孚,李秀伟,等. 宫颈病变中HDAC1的表达以及与HPV16感染的关系[J]. 中国妇幼保健杂志, 2011,26(8):1217-1219.

[5]王玉婷,王言奎,赵成琳. HPV16 E6和E7基因序列多态性与宫颈癌临床病理特征相关性[J]. 齐鲁医学杂志, 2011,26(4):308-310.

[6]高道键,徐岷,张玉琦,等. RNA干扰组蛋白去乙酰化酶1对人胰腺癌细胞增殖、凋亡的调控机制研究[J]. 解放军医学杂志, 2010,35(2):380-383.

[7]李娜,于世英. 组蛋白去乙酰化酶1 siRNA对HeLa细胞生长和凋亡的影响[J]. 华中科技大学学报:医学版, 2010,39(1):47-49.

[8]顾红军,董宇超,李强. HDAC1 siRNA转染对肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响[J]. 中国癌症杂志, 2010,20(8):578-582.

[9]张菡菡,胡金霞,孔丽君. VEGF-siRNA诱导MCF-7细胞凋亡及其机制[J]. 齐鲁医学杂志, 2013,28(1):1-4.

[10]NOWICKI T S, KUMMER N T, IACOB C, et al. Inhibition of uPAR and uPA reduces invasion in papillary thyroid carcinoma cells[J]. Laryngoscope, 2010,120(7):1383-1390.

[11]CARBONE C, MELISI D. NF-kB as a target for pancreatic cancer therapy[J]. Expert Opin Ther Targets, 2012,16(Supple 2):S1-10.

[12]马玉芳,陈新年. 宫颈癌组织中NF-kB和uPA的表达及意义[J]. 山东医药杂志, 2010,50(6):40-41.