链霉素抗性突变理性筛选新霉素高产菌株

陈宏 张祝兰 孙菲 张引 周璟明 郑榕

（福建省微生物研究所 福建省新药（微生物）筛选重点实验室，福州 350007）

链霉素抗性突变理性筛选新霉素高产菌株

陈宏 张祝兰 孙菲 张引 周璟明 郑榕

（福建省微生物研究所 福建省新药（微生物）筛选重点实验室，福州 350007）

采用化学诱变剂NTG结合链霉素抗性筛选法获得新霉素高产菌株。出发菌株费氏链霉菌（Streptomyces fradiae）FS1109的孢子悬液经不同剂量的化学诱变剂NTG处理后，涂布在含链霉素最小抑制浓度（3 μg/mL）的培养基平板上培养，获得大量的链霉素抗性突变株。经影印法初筛和摇瓶发酵复筛，正突变率高于负突变率，获得一株遗传性状稳定的Streptomyces fradiae Str 63菌株，其新霉素生物活性单位比出发菌株提高了50%以上，且C组分较出发菌株的低。

费氏链霉菌 新霉素 链霉素抗性筛选 突变

新霉素（Neomycin）系由费氏链霉菌（Streptomyces fradiae）［1］产生的氨基糖苷类抗生素［2，3］，是一种理想的干扰蛋白质合成的杀菌剂［4］，在临床和兽医学中有着广泛的应用，近年来市场对新霉素的需求急剧增长。新近的研究发现，新霉素能通过阻遏成纤维生长因子和内皮生长因子来干扰血管的形成，可能发展成为抗癌药物［5-7］。此外，近年来的研究还发现其具有巨大的抗HIV潜力，且新霉素A、B及其衍生物具有细胞毒性低的优点［8］。

目前，国内新霉素生产中普遍存在菌种发酵水平波动性大，低产率高单耗等严重缺陷，优良新霉素菌种的选育已成为提高新霉素产量和质量的首要任务。在菌种选育过程中，面临的首要问题是巨大的筛选工作。根据分子育种中关于抗生素产生菌抗性基因与抗生素合成的结构基因和调控基因紧密连锁而容易发生共突变的理论［9］，采用抗生素抗性筛选可以在较大程度上减少抗生素高产菌筛选的盲目性和不定向性，提高对目的菌的筛选效率，极大地减少诱变筛选的工作量。链霉素抗性筛选具有广谱性、正突变率和增产百分率高等特点，以链霉素抗性作为选择压力，对许多抗生素产生菌进行推理选育所得到的突变株中都有较高的高效价突变株出现

的频率［10-14］。

本研究采用化学诱变剂亚硝基胍（NTG）诱变处理使孢子产生DNA高频率突变，结合链霉素抗性筛选法，获得链霉素抗性突变株以筛选新霉素高产菌株，旨为工业化高效发酵生产新霉素提供优良菌种。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 弗氏链霉菌Streptomyces fradiae FS 1109，指示菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CPCC-160020，由福建省微生物研究所提供。

1.1.2 培养基 斜面培养基：高氏1号培养基。发酵培养基［15］：0.5%蛋白胨，2.8%花生饼粉，0.5%酵母粉，8.0%米粉，2.0%葡萄糖，0.25%玉米浆，0.025%淀粉酶，0.6%硫酸铵，0.45%碳酸钙，pH7.2。

1.2 方法

1.2.1 链霉素抗性突变株的制备

1.2.1.1 链霉素对Streptomyces fradiae FS 1109菌株孢子最小抑制浓度的测定 将制备好出发菌株的孢子悬液（浓度106个/mL）涂布在含不同浓度链霉素（1、2、3、5、10和20 μg/mL）的高氏1号培养基平板上，28℃培养8 d，观察平板上菌落生长情况。记录未长菌落平板上的链霉素最低浓度，即为链霉素对该菌的最小抑制浓度。

1.2.1.2 亚硝基胍诱变 亚硝基胍（NTG，Fluka Inc.）0.1 g，加少量的丙酮溶解后用Tris 缓冲液（pH8.0 Tris-HCl）配制不同浓度的NTG 溶液；用已灭菌的Tris 缓冲液制备孢子悬液，取孢子悬液与NTG 溶液按1∶1 混合，于28℃振荡处理20 min，用Tris 缓冲液稀释终止反应。

1.2.1.3 链霉素抗性突变株的筛选 NTG诱变处理的孢子稀释液分别涂布在含最小抑制浓度链霉素和空白对照培养平板上，28℃培养10 d，分别进行不同处理的菌落计数，凡是在含最小抑菌浓度链霉素平板上长出来的菌落均为链霉素抗性突变株。

1.2.2 链霉素抗性突变株高产菌株的筛选

1.2.2.1 初筛单菌落 分别将诱变的突变菌落挑接在高氏斜面上，并采用影印法将突变菌落进行生物活性检测。

1.2.2.2 摇瓶复筛 采用划线法将初筛入选菌株接种于装有一定量发酵培养基的三角瓶中35℃、220 r/min培养135 h，进行发酵生物效价测定及采用HPLC-EDC法检测组分。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 生物效价检测 参照《中国药典》2010 版抗生素微生物检定法（附录XI A），效价为3次平均值，以相对值标示。

1.2.3.2 新霉素C组分测定 采用HPLC-ECD方法。分离条件 Agilent zorbax-SB C18（5 μm，4.6×250 mm）色谱柱，以25 mL/L TFA+6 mL/L NaOH（50%，W/W）作为流动相，流速0.7 mL/min；柱后衍生液0.5 mol/L NaOH溶液，流速1 mL/min；电化学参数，E1=+0.1 V，E2=+0.8 V，E3=-0.6 V。

2 结果

2.1 链霉素抗性（Str）突变株的制备

2.1.1 链霉素对Streptomyces fradiae FS 1109菌株孢子的最小抑制浓度的确定 在试验中，当链霉素浓度≥3 μg/mL时，平板上无菌落生长。因此链霉素对FS 1109菌株孢子的最小抑菌浓度为3 μg/mL。

2.1.2 NTG对SF 1109菌株孢子的诱变效应 通过不同浓度的NTG对SF1109菌株孢子的诱变作用，将各种处理浓度的孢子悬液稀释不同倍数后分别涂布在含链霉素3 μg/mL和不含链霉素平板上，28℃培养10 d，分别作菌落计数，凡是在含链霉素3 μg/mL平板上长出来的菌落均为链霉素抗性（Str）突变株，其诱变结果见表1。

2.2 新霉素高产菌株的筛选

2.2.1 Str突变株高产菌株的筛选结果 对SF1109菌株孢子进行NTG处理后，涂布在含3 μg/mL链霉素的培养基平板培养，从中挑取180个抗性突变菌落进行初筛，经生物检测，以诱变出发菌株的发酵生物活性单位为100，计算突变株的相对发酵生物活性（表2），其中73株为正突变菌株（相对生物活性在110以上），50株为未突变菌株（相对生物活性在90-110），57株为负突变菌株（相对生物活性在90以下）。将初筛获得的正突变株通过摇瓶发酵培养进行复筛，经生物活性检测和HPLC-EDC定

量分析，最后选出6株良好的抗性突变株，分别为Str07、Str19、Str63、Str75、Str136和Str153，其中菌株Str63（图1）新霉素产量较出发菌株（图2）提高50%以上，且C组分较出发菌株低，见表3。

表1 不同浓度NTG对SF1109菌株孢子致死率与突变率的影响

表2 链霉素抗性突变株初筛结果

图1 菌株Str 63

图2 Streptomyces fradiae FS 1109

2.2.2 菌株Str63斜面保藏稳定性试验 将菌株Str63接种于斜面培养基上，待生长好后置于4℃保藏，测定保藏不同时间的菌株的发酵效价。以新鲜斜面为对照，结果其保藏10、20、30、60、90和120 d的相对效价分别为103%、111%、109%、97.6%、99.1%和98.5%。表明菌种斜面在4℃保藏4 个月稳定。

表3 抗性突变菌株高产菌株的摇瓶发酵情况

2.2.3 菌株Str63传代稳定性试验 对菌株Str63连续传代培养，以4℃冰箱保存7 d 生长良好的第一代菌株为对照，结果其第1、2、3、4和5代的相对单位分别为100%、103%、99.6%、98.1%和93.2%，表明菌株Str63传四代对发酵水平无明显影响。提示菌株Str63遗传稳定性较好。

3 讨论

新霉素（Neomycin）系由费氏链霉菌（Streptomyces fradiae）发酵产生的多组分抗生素，主要产物新霉素B组分相对其他组分而言活性强、毒性低。因此筛选新霉素发酵生物活性稳定，小组分含量低的高产菌种有利于其工业化生产，可提高产品质量，增强竞争力。

研究结果也显示了和相关文献［10，13］采用链霉素抗性筛选法取得正突变机率高于负突变的一致结果，可推测该弗氏链霉菌的链霉素抗性基因突变与新霉素发酵生物活性突变紧密相关。链霉素抗性是由于编码核糖体蛋白S12的rpsL基因或其它基因发生突变导致核糖体或核糖体蛋白发生改变而产生，虽然核糖体相关基因改变对抗生素产生菌次级代谢

产物生物合成的影响虽然已有较多研究［16，17］，但不明机制仍然较多，核糖体相关基因的改变如何调控菌株的次级代谢有待进一步探索与研究。

4 结论

本研究组合运用NTG诱变与链霉素抗性突变株筛选新霉素高产菌株的方法，获得了1 株高产新霉素高产的突变菌株Streptomyces fradiae Str63，其新霉素生物活性单位比原出发菌株提高50%以上，且C组分较出发菌株的低，为工业化生产新霉素奠定了基础。

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（责任编辑 李楠）

Streptomycin-resistant Rational Screening for High-yield Neomycin Producing Strain

Chen Hong Zhang Zhulan Sun Fei Zhang Yin Zhou Jingming Zheng Rong
（Fujian Institute of Microbiology，Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products，Fuzhou 350007）

NTG mutagenesis and streptomycin resistance screening was applied to screen neomycin high producing strain. A number of streptomycin-resistant（str）mutants were obtained from original strain of Streptomyces fradiae FS1109 treated with three different dosage of NTG under the selection pressure of resistance to streptomycin（the lethal concentration is 3 μg/mL）. Streptomycin-resistant mutants strain Str63 was obtained with high neomycin yield by replica plating method and the neomycin productivity could be more than 50% higher and the component of C was lower than that of the original strain in the rotation-flask experiments, the rate of the positive mutation was larger than that of the negative mutation.

Streptomyces fradiae Neomycin Streptomycin resistance screening Mutation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.029

2014-05-13

国家“十一五”“重大新药”创制项目（2010ZX09401-403），福建省自然科学基金项目（2012J01094）

陈宏，高级工程师，研究方向：微生物菌种选育与发酵；E-mail：peaceful88@163.com

张祝兰，研究员，研究方向：微生物药物；E-mail：jessylan9963@sina.com.