奶牛子宫内膜细胞体外培养及应用研究概况

邝晓娇，张世栋，董书伟，王东升，魏立琴，严作廷

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃兰州 730050）

子宫内膜（endometrium）构成雌性哺乳动物子宫壁的最内层，位于子宫腔面，在动物生殖生理活动中占有重要地位。正常的子宫内膜由上皮和其下方的固有层组成。上皮层主要由具有分泌功能的子宫黏膜上皮（gland epithelium）构成；固有层主要是子宫内膜基质细胞（endometrial stromal cells）构成的结缔组织，与网状纤维和基质等成分构成间质［1-2］。由于子宫内膜上皮细胞和子宫内膜基质细胞均可受卵巢激素的影响产生周期性的变化，且在子宫内膜细胞中占有数量上的优势，所以子宫内膜细胞的体外培养主要是对子宫内膜上皮细胞和基质细胞的培养［3-4］。细胞体外培养技术不仅可以直观地对所培养的细胞进行观察处理，还可以避免在体条件下多种生理因素带来的研究干扰。因此，在子宫内膜生殖生理相关的细胞学研究中，建立稳定有效的子宫内膜细胞体外培养体系具有重要意义。近年来，国内外有关奶牛子宫内膜细胞的体外培养及其相关应用的研究不断呈现新的进展，为奶牛繁殖生理的研究提供了重要的基础意义。

1 奶牛子宫内膜细胞的体外分离与培养

早在20世纪80年代，国外学者就开展了子宫内膜细胞体外培养的研究工作。Fortier M A等［3］利用胰蛋白酶、胶原酶和DNA酶分步消化的方法首次成功分离出奶牛子宫内膜上皮细胞和基质细胞。随后，国内外研究者在该方法的基础上加以改进，利用组织块培养、网筛过滤等方法相继成功获得了奶牛子宫内膜细胞［5-8］。

1.1 奶牛子宫内膜细胞的体外分离与培养

1.1.1 样品采集 取黄体初期至中期（发情2d～12d）未孕健康奶牛新鲜子宫（死亡10min左右），剥离脂肪组织，生理盐水冲洗干净，用冰冷无菌、无钙镁离子的 Hank′s平衡盐溶液（IHBSS）（含青霉素100单位／mL、链霉素100μg／mL）保存，并置于冰上尽快送往实验室［5-6］。

1.1.2 细胞分离与培养

1.1.2.1 分步消化法 无菌条件下，剪开子宫角，暴露子宫腔，取子宫内膜组织，加入3g／L胰蛋白酶22℃水浴消化2h，胎牛血清（FBS）终止消化。收集细胞悬液，离心漂洗2遍，加入细胞分离液除去污染的血细胞，IHBSS液清洗两遍，收集子宫内膜细胞，用RPMI-1640培养基（含50μg／mL青霉素、50 μg／mL链霉素及100mL／L热灭活的FBS）稀释浓度至5×105个／mL，置于37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱中培养。每48h换液1次，直至细胞融合。上述除去上皮细胞的组织块，经消化液（含0.2g／L胰蛋白酶、0.2g／L胶原酶Ⅱ、0.15%DNaseI，IHBSS溶液配制 ）37℃水浴消化1h后，加入适量FBS终止消化。将组织块漂洗2次，加入含100mL／L FBS的 RPMI-1640培养基置于37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度下进行组织块培养。18h后更换培养液，所得贴壁细胞基本为子宫内膜基质细胞［6］。

1.1.2.2 筛网过滤法 无菌条件下将切碎的子宫内膜组织放入25mL消化液（含0.5mg／mL胰蛋白酶Ⅲ、0.5mg／mL 胶原酶Ⅱ、1mg／mL BSA 和 0.1 mg／mL DNaseI，Hanks液配制），37℃恒温摇床消化1h～1.5h后，将细胞悬液经孔径40μm的筛网过滤，除去未消化的组织。滤液重悬于洗液（含100 mL／L FBS、3μg／mL胰蛋白酶抑制剂，HBSS液配制），100r／min离心10min，收集细胞，重新漂洗1遍后，加入 RPMI-1640培养基（含100mL／L FBS，50 IU／mL青霉素、50μg／mL链霉素和2.5μg／mL两性霉素B），调整细胞浓度为1×105个／mL并接种于24孔培养板中，每孔2mL，置于37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度下培养。培育18h后，转移培养液至另一个24孔培养板继续培养，即可获得上皮细胞；而前一板中先贴壁的细胞即为基质细胞［9-10］。

1.1.2.3 组织块培养法 无菌条件下，取子宫内膜组织反复剪切至1mm3大小，用弯头吸管吸取适量组织块放入培养皿中，组织块间距离以0.5cm为宜。倒置培养皿于37℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱中2h～4h。然后正置培养皿，并轻轻注入少量含200mL／L FBS的DMEM／F12培养液，在培养箱中静置培养，24h后补加培养液至足量。每天观察细胞从组织块爬出情况，每2d～3d换液1次［7，10-12］。

1.1.2.4 组织块消化培养法 无菌条件下，组织块剪碎至1mm3大小，加入2.5g／L胶原酶Ⅰ溶液在37.5℃水浴匀速晃动消化1h～1.5h。低速离心并收集沉淀，漂洗2次后将组织块转移至培养皿，组织块间距0.5cm为宜，并用移液器吸去组织块周围液体，37℃、体积分数为5%CO2的细胞培养箱中孵育。3h后补加1mL完全培养液以覆盖组织块而不漂起为准，继续培养。待组织块贴壁后补加4mL完全培养液，以后每隔3d更换2／3的培养液，直至细胞长满培养皿底部［8，13］。

综上所述，目前国内外学者已经能够在体外成功分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞和基质细胞，并能达到一定的纯度满足研究要求。然而，国内外学者利用奶牛子宫内膜组织体外培养子宫内膜细胞的方法有一定差异。国外研究者使用最多的为筛网过滤法，即将组织块经过消化液消化，经网筛过滤直接获得子宫内膜单细胞，且纯度较高，常常不需要进一步纯化即可满足实验要求［10，14］。但是该方法由于消化过程受温度、时间、酶活力等影响较难控制，操作中往往造成细胞消化性损伤。损伤的细胞生长性能受到影响，易老化凋亡，且其操作较为繁琐，过滤离心等过程增加了污染的几率。国内研究人员多使用组织块消化法，该法是在国外已有方法的基础上作了一定的改进。例如，简化多种消化液成分（如胰蛋白酶、胶原酶、BSA和DNaseⅠ等）为一种成分（胶原酶）；省略去除血细胞及通过网筛过滤等步骤；替换广为使用的普通RPMI1640培养基，使用有促上皮细胞生长作用的DMEM／F12混合培养基，以提高培养效率等。该方法操作简单，获得细胞形态均一，成功率较高。但是与国外技术相比，所获得的子宫内膜细胞纯度不高，混合生长的成纤维细胞较多，且往往需要多次纯化的过程，比较麻烦。总之，如何将国内外常用体外培养方法的优势充分结合，建立起简捷、快速、稳定有效的体外培养奶牛子宫内膜细胞模型，并保持传代细胞的生物学特性等的方法还有待进一步探究。

2 体外培养奶牛子宫内膜细胞的纯化

原代培养的奶牛子宫内膜细胞群主要是上皮样细胞和成纤维样细胞混合生长的状态，实验室常根据二者贴壁速度和对酶的敏感度不同将其分离纯化。

2.1 差速贴壁法

混合细胞悬液接种后，可在2h后更换培养液，此时基质细胞已发生选择性贴附，可将基质细胞与血细胞和残余的上皮细胞分离。由于上皮细胞接种后24h～48h才能贴壁，所以选择18h后更换培养上皮细胞的培养液，间质细胞充分贴壁而被除去，更换出来的培养液主要含有上皮细胞，可重新接种于培养板，每2d更换1次培养液，直至细胞融合［15-16］。

2.2 差时消化法

混合态细胞基本长满培养皿时，加入2.5g／L胰蛋白酶，在倒置显微镜下观察，当绝大多数成纤维细胞变圆、部分脱落时，终止消化。用吸管轻轻吹打细胞，待成纤维细胞完全脱落后，收集液体继续培养，所得细胞即为基质细胞；剩余贴壁细胞即为上皮细胞，用少量培养基冲洗2次后，加入适量培养基，继续培养。培养3d左右，观察细胞，若上皮细胞中仍明显有成纤维细胞生长，再重复1次胰酶差时消化得到纯化的细胞［12-13］。

以上两种纯化方法各有利弊。国外研究者在分离纯化子宫内膜细胞过程中先经过网筛过滤，再结合差速贴壁法，利用各细胞贴壁速度不同将所需细胞分离出来。该方法操作简单，避免细胞发生变化，所得细胞纯度较高，不足之处是有可能损失一定数量的细胞。差时酶消化法是国内最常用的纯化方法，其优点是不仅能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶耐受性的不同，使两者分开，达到纯化的目的，而且对贴壁细胞与半贴壁细胞及黏附细胞间的分离纯化也是十分有效的，但其缺点是消化程度很难控制，而且往往可能需要多次传代才能达到目的，实验周期较长。另外，近些年迅速发展起来的细胞分选纯化技术，如流式细胞术、免疫磁珠技术，由于其具有速度快、精度高、准确性好等优点，在分离纯化某些特殊细胞时优势明显［17-18］，还未在奶牛子宫内膜细胞学研究中广泛应用，有待进一步探索。

3 体外培养奶牛子宫内膜细胞的鉴定

3.1 形态学观察

倒置显微镜下观察，子宫内膜上皮细胞体外接种24h后大部分都已贴壁，呈多边形或蝌蚪形；2d～3d后，细胞出现涡旋状生长，呈现典型上皮细胞的铺路石状，细胞间形成紧密连接，细胞形态较规则，核大而圆，核仁明显，透明度小；连续传代后，细胞变薄，细胞质透明度增加，核轮廓不清，甚至出现“空泡样”变化，贴壁性能逐渐下降，逐渐呈成纤维细胞样生长，直至凋亡。子宫内膜基质细胞呈典型的成纤维样梭形，胞浆丰富，核椭圆，在组织块培养初期生长迅速，呈漩涡轮层状生长，细胞之间平行连接成束，4d～5d即可融合成片［19］。

3.2 免疫组化染色

现已证明角蛋白存在于子宫内膜上皮细胞内，而波形蛋白存在于基质细胞内。利用生物素等标记的牛角蛋白抗体可使子宫内膜上皮细胞特异性显色，而基质细胞不着色；利用生物素等标记的牛波形蛋白能使子宫内膜基质细胞染色，而上皮细胞不着色［20-21］。利用这一特点可以分别将子宫内膜上皮细胞和基质细胞鉴定。此外，借助图像灰度分析技术对免疫组化染色结果进行图像统计分析，一定程度上可判断细胞的纯度。国外研究者因为在细胞分离与纯化过程中利用网筛过滤、差时贴壁等方法所获细胞纯度较高，因此常常只采用形态学观察即可完成鉴定细胞纯度是否符合实验要求。而国内研究人员由于没有网筛过滤等步骤，则往往需要进一步通过免疫组化技术鉴定其纯度。对于广泛应用于人源性细胞的STR（short tandem repeat，短串联重复序列）分型等技术通过DNA含量、RNA和蛋白质以及酶活性等分子生物学方法快速鉴定细胞技术日益成熟［22］，但是利用这些方法鉴定奶牛子宫内膜细胞的报道还未见到。

4 奶牛子宫内膜细胞的传代培养

在倒置显微镜下观察，当纯化后的细胞融合率达80%～90%时，采用胰蛋白酶消化细胞并进行常规传代培养。无菌条件下，弃去培养液，用无菌PBS液冲洗2遍，然后加入2.5g／L胰蛋白酶和0.2g／L EDTA混合液（V／V＝1∶1）1mL，置37℃培养箱中消化10min左右。显微镜下观察到大部分细胞收缩变圆时，倒去消化液，加入含有血清的培养液终止消化，用吸管轻轻将细胞自瓶壁全部吹打下来。取适量吹打均匀的细胞悬液，细胞计数板计数后，按1∶2或1∶3的比例进行接种培养［6-8］。

5 体外培养奶牛子宫内膜细胞的应用概况

Asselin E等检测到子宫内膜上皮细胞和基质细胞分泌激素分别为前列腺素F2α（PGF2α）和前列腺素E2（PGE2）；Herath S等［10］利用内毒素（LPS）诱导奶牛子宫内膜细胞炎症反应，发现基质细胞能分泌少量PGF2α，而上皮细胞不能分泌PGE2，同时首次在奶牛子宫内膜发现Toll样受体4（TLR4）；Fischer C等［23］通过体外培养奶牛产后21d～27d子宫内膜的上皮细胞，研究细胞中一系列炎性因子的基因表达变化与子宫内膜炎症的关系，结果表明CXL趋化因子5（CXCL5）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素8（IL-8）和肿瘤坏死因子（TNF）等基因可作为隐性子宫内膜炎诊断和治疗的监测指标；Swangchan-uthai T等［20］利用体外细胞炎症模型研究了炎症发生过程中TLR4／CD14／MD2信号传导通路、细胞因子（IL-1β、TNFα）、趋化因子（IL-8、CXCL5）、抗菌肽（LAP、S100A8、S100A9、S100A12）、金属蛋白酶（MMP1、MMP13）以及前列腺素合成酶等蛋白及其基因表达变化的特征，揭示了S100族Ca2＋结合蛋白在炎症发生过程中的抗菌作用以及奶牛子宫内膜细胞在LPS刺激时的基因表达模式；Cronin J G 等［9］利用体外细胞炎症模型的研究表明，奶牛子宫内膜上皮细胞和基质细胞通过TLR4／MYD88信号转导通路发挥先天免疫功能；Chapwanya A等［14］对体外上皮细胞的应用研究表明急性期蛋白基因SAA3的表达变化很可能为奶牛子宫内膜炎症诊断和治疗提供新方案；Turner M L等［24］的研究表明奶牛子宫内膜上皮细胞和基质细胞通过TLR2、TLR1和TLR6等受体对LPS产生更为广泛的炎症应答机制。

近年来，随着国内学者对奶牛子宫生理功能和炎症反应机理等分子细胞学水平研究的重视，在学习国外先进技术的同时，紧密结合我国奶牛子宫疾病研究现状，有关奶牛子宫内膜细胞的体外培养和体外应用的工作不断展开，新的研究成果也不断涌现。张明等［25］以不同浓度的孕酮处理体外混合培养的子宫内膜基质细胞和上皮细胞，发现随着孕酮浓度的增加孕酮受体（PR）基因表达量逐渐下降，虽然这与Xiao W C等把子宫内膜细胞单独培养的研究结果存在一定差异，但更好地丰富了激素的作用模式；杜金梁等［26］在国内首次报道了奶牛子宫内膜炎体外细胞模型的研究，并利用该细胞模型探讨了益母生化散对治疗奶牛子宫内膜炎的作用机理；张桂林等［27-28］发现LPS对体外奶牛子宫内膜上皮细胞的毒性作用呈浓度和时间依赖效应，并证明奶牛子宫内膜上皮细胞中存在LPS介导的NF-kB信号通路；刘珊［29］通过体外试验利用脂磷壁酸（LTA）、LPS、孕酮（P）和雌二醇（E2）建立细胞模型，证明E2、P对子宫内膜上皮细胞免疫水平的影响可以通过调节TLRs的表达及诱导产生细胞因子和炎症趋化因子来实现；吴岳［13］通过上皮细胞体外培养及研究发现在奶牛早期IFN-τ对奶牛子宫上皮细胞MICB和BoLA-A的表达均具有显著的抑制作用，这种抑制作用对于胎儿逃避母体免疫系统识别、保证正常着床起关键作用；肖雅等［21］则通过IFN-τ干预奶牛子宫上皮细胞中BoLA-I重链的表达，为探索IFN-τBoLA-I重链—子宫上皮细胞之间的免疫调节通路提供依据。

综上所述，奶牛子宫内膜细胞体外培养模型主要应用于奶牛子宫内膜生理机能、发病机制及药物筛选等方面的研究。相比之下，人和小鼠子宫内膜细胞体外培养体系较为成熟，其体外细胞模型已广泛用于人妇产科、生殖医学、分子生物学等多种领域的研究［30-31］，这对兽医领域中奶牛子宫内膜细胞的类似研究具有很好的指导和借鉴意义。

6 结语

综上所述，目前已经能够在体外成功分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞和基质细胞，并能达到一定的纯度满足研究要求。研究人员利用建立的体外细胞模型，结合免疫组织化学、细胞生理学以及分子生物学的研究方法，已经对奶牛子宫内膜细胞的生理功能和一些作用机制有了更深层次的研究。但是，如何优化目前所用的体外培养方法，简便、快速地立稳定有效的奶牛子宫内膜细胞体外培养模型，并借鉴人［32］、山羊子宫内膜细胞［33］、奶牛乳腺上皮细胞［34］等体外永生化研究，使得牛子宫内膜细胞培养实现体外无限增殖且细胞间无差异成为可能，还须进一步的研究。另外，利用子宫内膜细胞体外模型在研究奶牛子宫内膜生殖生理及炎症机制等方面，虽已发现部分相关信号通路及药物作用靶标，但仍涉及大部分作用机理尚不清楚，相应药物临床治疗还不成型等一系列难题。随着研究的进一步深入，有望找到更完善的奶牛子宫内膜细胞体外培养方法，进而将其用于胚胎着床期、妊娠期生理变化、药物筛选以及子宫抗炎机制等方面的研究，从而为揭示奶牛子宫内膜相关疾病奠定一定基础。

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