抑制JNK磷酸化参与褪黑素对花萼海绵诱癌素引起的tau蛋白过度磷酸化的保护机制

李夏春，王志强，柳秀平

(1.三峡大学医学院病理生理教研室，湖北宜昌 443002；2.杭州市中医院，浙江杭州 310006)

抑制JNK磷酸化参与褪黑素对花萼海绵诱癌素引起的tau蛋白过度磷酸化的保护机制

李夏春1，王志强1，柳秀平2

(1.三峡大学医学院病理生理教研室，湖北宜昌 443002；2.杭州市中医院，浙江杭州 310006)

目的 探讨花萼海绵诱癌素(CA)在成神经瘤细胞(N2a)引起tau蛋白过度磷酸化的机制,及褪黑素对其是否具有保护作用。方法 小鼠成神经瘤细胞(N2a)给予CA 5 nmol·L－1处理,或同时给予褪黑素50 mol·L－1,或同时给予维生素E(Vit E)50 mol·L－1处理12 h,用免疫印迹技术检测tau蛋白在Ser422位点的磷酸化水平,磷酸化c-jun氨基端激酶(p-JNK)和磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶(p-MKK4)的含量,免疫荧光检测p-JNK含量和分布,荧光法测定细胞内丙二醛(MDA)含量,32P-特异底物标记技术检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)活性。结果 CA在N2a细胞引起tau蛋白Ser422位点磷酸化水平显著升高(1.70±0.19,1.0,P＜0.01),褪黑素拮抗CA引起的tau蛋白Ser422位点过度磷酸化(0.98± 0.12,1.70±0.19,P＜0.01)；CA引起细胞内MDA含量升高(μmol·g－1蛋白,0.241±0.006,0.141±0.006, P＜0.01),褪黑素和Vit E均可抑制CA引起的细胞内 MDA含量升高(μmol·g－1蛋白,0.172±0.004, 0.193±0.005,0.241±0.006,P＜0.01)；CA不改变p38MAPK活性和蛋白水平,但引起p-JNK含量升高(1.91±0.27,1,P＜0.01)和p-MKK4(1.81±0.09,P＜0.01)含量升高,褪黑素抑制CA引起的p-JNK含量升高(1.11±0.15,1.91±0.27,P＜0.01)和p-MKK4(1.14±0.06,1.81±0.09,P＜0.01)含量升高；JNK抑制剂SP600125可抑制CA诱导的tau蛋白过度磷酸化,MKK4磷酸化抑制剂地昔帕明可消除CA诱导的JNK磷酸化和tau蛋白过度磷酸化。结论 褪黑素抑制JNK磷酸化参与其对CA诱导的tau蛋白Ser422位点过度磷酸化的预防作用。

褪黑素；花萼海绵诱癌素；tau磷酸化；丝裂原活化蛋白激酶激酶4

脑神经元内出现神经原纤维缠结 (neurofibrillary tangles，NFT)是阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的主要病理特征之一。研究表明，NFT与患者的痴呆程度呈显著正相关[1]。因此，揭示NFTs形成的机制并寻找阻断药物是目前AD研究的重点。NFT主要由过度磷酸化的tau蛋白构成。用AT-8，PHF-1和pS422抗体进行流式细胞分析发现AD患者脑皮质突触富含磷酸化的tau[2]。用结合Ser422位点磷酸化的tau的肽段进行免疫，AT100和ps422抗体显示其降低不溶性tau的量，并可使tau转基因小鼠在Y迷宫的新臂中的活动时间显著延长[3]。说明tau的Ser422位点磷酸化是AD患者认知障碍的关键因素。AD患者常有睡眠-觉醒节律紊乱和褪黑素水平严重降低[4]。且AD患者应用褪黑素治疗后夜间行为激进和认知障碍明显改善[5]。近期有报道腹腔注射褪黑素9 d可预防花萼海绵诱癌素(calyculin A，CA)诱导的突触素丢失和记忆维持障碍及 tau蛋白过度磷酸化[6]。AD患者常有蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase 2A，PP-2A)活性下降，并且随着PP-2A活性下降，tau蛋白在tau-1，AT-8，CP13，pS262，pS422位点的过度磷酸化增加[7]。这说明PP-2A活性下降参与tau蛋白pS422位点过度磷酸化和AD患者的认知障碍。作者曾报道褪黑素减轻CA所致tau蛋白Ser199，Thr205，Ser396过度磷酸化的机制与褪黑素升高PP-2A活性和对抗CA所致氧化应激有关[8]。因为氧化应激可激活应激相关激酶，为探讨褪黑素改善记忆的可能机制，本研究应用CA处理N2a细胞，或同时给予褪黑素，或同时给予维生素E(vitamin E，Vit E)处理，探讨CA引起tau蛋白过度磷酸化的机制，及褪黑素对其是否具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂和抗体

培养细胞所用胎牛血清(FBS)、DMEM、Opti-MEM购自美国 Gibco公司；十二烷基硫酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、丙烯酰胺(Arc)、N，N-亚甲叉-双丙烯酰胺(Bis)小牛血清白蛋白(BSA)、褪黑素、Vit E、地昔帕明、SP600125均购自美国Sigma公司；BCA蛋白检测试剂盒和过硫酸铵(AP)购自美国Pierce公司；硝酸纤维素膜(NC膜)购自美国Hybond公司；多克隆抗体R145d(1∶1000)为王建枝教授馈赠；多克隆抗体111e(识别总tau，1∶500)购自美国Sternberger公司，多克隆抗体 p38MAPK(C-20)(sc-535)，p-JNK(G-7)(sc-6254)，购自美国Santa Cruz公司，多克隆抗体 MKK4(1∶1000)、JNK(9252) (1∶1000)，p-MKK4(Ser257/Thr261)(1∶1000)，β肌动蛋白抗体(1∶1000)为美国Cell Signaling公司产品。HRP标记羊抗鼠、羊抗兔IgG二抗和ECL显色液为美国Santa Cruz公司产品；CA购自美国Biochemical公司；[32P]ATP北京亚辉生物医药公司产品。

1.2 细胞培养

小鼠成神经瘤细胞株(N2a)由华中科技大学王建枝教授赠予。细胞用DMEM/Opti-MEM(1∶1)培养基(FBS 50 g·L－1)，在5%CO2，37℃细胞培养箱内进行培养，2～3 d更换培养基。当细胞生长至70%～80%丰度时，用无血清培养基培养12 h诱导细胞分化，再进行给药处理。

1.3 Western蛋白质印迹法检测 tau蛋白和MKK4/JNK磷酸化水平

①细胞分别用等体积DMSO，CA 2.5，5.0，10 nmol·L－1处理12 h；或分别用等体积DMSO，CA 5.0 nmol·L－1，CA 5.0 nmol·L－1＋褪黑素25，50和100 μmol·L－1共处理12 h；或用等体积DMSO，CA 5.0 nmol·L－1，CA 5.0 nmol·L－1＋褪黑素50 μmol·L－1，CA 5.0 nmol·L－1＋VitE 50 μmol·L－1处理12 h。

② 细胞分别用等体积 DMSO，SP600125 40 μmol·L－1，CA 5 nmol·L－1＋SP600125 5，10，20和40 μmol·L－1(SP600125预处理2 h后给予CA处理12 h)；或等体积DMSO，地昔帕明20 μmol·L－1处理2 h，CA 5 nmol·L－1处理12 h，CA 5 nmol·L－1＋地昔帕明5，10，20 μmol·L－1(地昔帕明预处理2 h后给予CA处理12 h)。

以上处理完毕，立即提取细胞蛋白，测定细胞浓度，进行免疫印迹分析[9]。免疫印迹结果扫描后用Image J图像分析软件分析。以目标蛋白的积分吸光度值与内标蛋白积分吸光度值的比值表示蛋白的相对表达水平。

1.4 细胞内丙二醛(maIondiaIdehyde，MDA)含量测定

N2a细胞按正常组(等体积 DMSO)，CA 5.0 nmol·L－1组，褪黑素(褪黑素50 μmol·L－1＋CA 5.0 nmol·L－1组， Vit E 50 μmol·L－1＋CA 5.0 nmol·L－1的分组加药处理12 h，弃培养基，PBS洗涤2遍，细胞刮收集细胞。采用荧光法进行细胞内MDA水平测定[10]。

1.5 p38MAPK水平及活性的检测

1.5.1 Western蛋白质印迹法检测p38MAPK表达水平

细胞种植于 6孔板，按正常组(等体积DMSO)，CA 5.0 nmol·L－1，褪黑素50 μmol·L－1＋CA 5.0 nmol·L－1，VitE 50 μmol·L－1＋CA 5.0 nmol·L－1给药处理12 h后，每孔加入 80 μL温和裂解液(mmol·L－1:Tris-HCl 10，pH 7.4，NaCl 150，EGTA 2，DTT 2，Na3VO43，NaF 20，苯甲基磺酰氟1和胰蛋白酶抑制剂 2 μg·L－1)，4℃匀浆10 min，收集细胞裂解液，18 000×g，4℃离心15 min，取上清，BCA法测样品浓度。先各组取10 μg 10%琼脂糖SDS电泳和印迹，用肌动蛋白抗体检测其表达水平。各组再取 200 μg上清与p38MAPK抗体1 μg于4℃孵育过夜，先取30 μg免疫沉淀样品加入 20 μL 2×上样缓冲液，煮沸5 min，进行10%琼脂糖 SDS电泳和印迹，检测p38MAPK水平。以p38MAPK抗体的积分吸光度值与β肌动蛋白抗体的积分吸光度値的比值表示p38MAPK的表达水平。

1.5.2 放射免疫标记方法测定p38MAPK活性

按1.5.1处理的部分沉淀的蛋白样品先用50 μL蛋白G琼脂糖孵育1 h，蛋白琼脂糖珠用温和裂解液洗涤3次，再用激酶缓冲液(mmol·L－1HEPES 20 pH 7.6，MgCl220，β-甘油磷酸20，对硝基苯磷酸二钠20，Na3VO40.1，DTT 2)洗涤2次，取30 μL蛋白琼脂糖珠加入总体积40 μL的激酶缓冲液中，和[32P]ATP 50 μmol·L－1(每皮摩尔ATP的cpm值为1500)和髓鞘质碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)0.2 mg·L－1，振荡混匀，30℃孵育30 min，各取10 μL反应混合物滴在磷酸纤维素滤纸上终止反应。先用0.85%的磷酸洗磷酸滤纸5×5 min，再用丙酮洗5 min。膜60℃干燥过夜后放入液闪瓶内，加入二甲苯闪烁液，底物结合的放射性通过液闪仪计数。p38MAPK的活性以MBP结合的cpm值表示。

1.6 免疫荧光染色检测磷酸化JNK水平和分布

N2a细胞以每孔5×105的密度接种在12孔板中，孵育24 h，待细胞生长达70%丰度时，去血清培养 12 h；再按正常组(等体积 DMSO)，CA 5.0 nmol·L－1，褪黑素50 μmol·L－1＋CA 5.0 nmol·L－1，Vit E 50 μmol·L－1＋CA 5.0 nmol·L－1给药处理12 h后，细胞用冷PBS洗2次，用4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗1次，体积分数为0.003的Triton-X100破细胞膜5 min，BSA 10 g·L－1孵育1 h；细胞再与适当稀释的p-JNK抗体 (1∶250)在4℃孵育过夜，PBS洗4次；与二抗(荧光素异硫氰酸盐标记羊抗兔IgG)37℃孵育1 h；用PBS洗4次；用DAPI(0.1 mg·L－1)染核；用Zeiss LSM 710激光共聚焦显微镜(Zeiss，Jena，德国)并用543 nm激发光560 nm滤片和40X/0.75 M27目镜摄像。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的N2a细胞tau蛋白和MKK4/JNK磷酸化水平的影响

图1A1和图1A2显示，与正常组相比，CA 2.5，5.0和10 nmol·L－1处理引起Ser422位点磷酸化tau蛋白水平显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，但CA 5与10 noml·L－1组间磷酸化tau蛋白水平并无差异，且各组总 tau水平无改变(图略)。说明 CA 5 nmol·L－1是引起tau蛋白Ser422位点过度磷酸化的最适浓度。图1B1和图1B2显示，与正常对照组相比，CA组tau蛋白Ser422位点磷酸化水平显著升高(P＜0.01)，与CA组相比，同时给予褪黑素25，50和100 μmol·L－1tau蛋白Ser422位点磷酸化水平低(P＜0.01)，50 μmol·L－1组的磷酸化水平最低，说明褪黑素抑制CA诱导的tau蛋白磷酸化的最适浓度是50 μmol·L－1。图1C1和图1C2显示，与正常对照组相比，CA处理显著升高p-JNK/ JNK比值(P＜0.01)，同时给予褪黑素或Vit E使p-JNK/JNK比值低于CA组(P＜0.01)，说明JNK激活可能参与CA诱导的tau蛋白Ser422过度磷酸化，褪黑素抑制CA诱导的JNK过度磷酸化激活可能参与其抑制tau蛋白Ser422位点过度磷酸化。图1D1和图1D2显示，CA组的p-MKK4(Ser257/ Thr261)/MKK4比值显著高于正常组(P＜0.01)，褪黑素组和Vit E组的此比率均显著低于CA组(P＜0.01)，说明MKK4激活可能参与CA诱导的JNK磷酸化激活和tau过度磷酸化，褪黑素和Vit E可抑制MKK4激活减轻CA诱导的JNK磷酸化激活和tau过度磷酸化。

Fig.1 Effect of caIycuIin A(CA)and meIatonin(Mt) on phosphoryIation of tau at Ser422 site JNK and MKK4 by Western bIotting.In Fig.A1，lane 1:DMSO；lanes 2－4；CA 2.5，5 and 10 nmol·L－1for 12 h，respectively.In Fig.B1，lane 1:DMSO；lane 2:CA 5 nmol·L－1；lanes 3－5:CA 5 nmol·L－1＋melatonin 25，50 and 100 μmol·L－1，respectively.In Fig.C1 and Fig.D1，lane1:DMSO；lane 2:CA 5 nmol·L－1；lane 3:CA 5 nmol·L－1＋melatonin 50 μmol·L－1；lane 4:CA 5 nmol·L－1＋Vit E 50 μmol·L－1.A2，B2，C2 and D2 were the semi-quantitative results of A1，B1，C1 and D1，respectivelyn＝5.∗P＜0.05，∗∗P＜0.01，compared with control group；＃＃P＜0.01，compared with CA group.

2.2 褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的N2a细胞MDA含量的影响

表1结果显示，与正常对照组相比，CA处理组细胞内MDA水平显著升高，同时给予褪黑素或Vit E处理其MDA水平显著低于CA组(P＜0.01)。说明CA可诱导氧化应激，褪黑素和Vit E可显著抑制CA诱导的氧化应激。

Tab.1 Effect of meIatonin on maIondiaIdehyde(MDA) content of N2a ceIIs

2.3 褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的N2a细胞p38MAPK水平及活性的影响

图2A的免疫印迹结果和半定量分析显示，各组p38MAPK含量基本相等，各组p38MAPK磷酸化MBP结合的[32P]ATP的cpm值无显著差异(图2B)，说明各组p38MAPK活性无显著差异，说明CA诱导的氧化应激并不激活p38MAPK也不诱导其表达水平改变。

Fig.2 Effect of meIatonin(Mt)on p38-mitogen activated protein kinase(p38MAPK)expression by Western bIotting(A)and activity of p38MAPK by radioimmunobIotting(B)of N2a ceIIs treated with CA.A:Lane 1，DMSO；lane 2:CA 5 nmol·L－1，lane 3:CA 5 nmol·L－1＋Mt 50 μmol·L－1；lane 4:CA 5 nmo·lL－1＋Vit E 50 μmol·L－1n＝5.

2.4 褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的N2a细胞JNK水平和分布的影响

图3的磷酸化JNK抗体免疫荧光成像结果显示，正常N2a细胞体积较大，细胞核较大呈椭圆形，磷酸化JNK均匀分布于胞浆和胞核(图3A)；CA处理后大部分细胞体积显著变小，细胞核较小呈马蹄形，磷酸化JNK增多且聚集在胞核及其周围(图3B)；褪黑素和CA共处理组部分细胞体积较大，具有长突起，细胞核大呈椭圆形，磷酸化JNK弥散分布于细胞核和胞浆，部分细胞核内有JNK聚集，但比CA组显色显著减弱(图3C)；Vit E和CA共处理组与褪黑素和CA共处理组呈相似变化(图3D)。这进一步证明激活JNK磷酸化参与CA诱导的tau蛋白过度磷酸化，褪黑素和Vit E可部分拮抗CA诱导的JNK磷酸化。

Fig.3 Effect of meIatonin on IeveI and distribution of phosphoryIated c-Jun N-terminaI kinases(p-JNK)of N2a ceIIs treated with CA by immunofIuorescnce. A:DMSO；B:CA 5 nmol·L－1；C:CA 5 nmol·L－1＋melatonin 50 μmol·L－1；D:CA 5 nmol·L－1＋Vit E 50 μmol·L－1.1:DAPI；2:p-JNK；3:merge.

2.5 抑制MKK4/JNK信号途径对CA诱导的tau蛋白S422位点磷酸化的影响

图4A1和图4A2显示，与正常对照组相比，单独给予SP600125 40 μmol·L－1预处理2 h组tau蛋白Ser422位点磷酸化水平和p-JNK水平无变化，但与 CA处理组相比，SP600125 5，10，20及40 μmol·L－1预处理组均显著抑制CA诱导的S422位点磷酸化tau蛋白水平升高，且其抑制p-JNK水平升高的效应呈浓度依赖性(r＝0.95，P＜0.01)，表明JNK磷酸化参与CA诱导的tau蛋白Ser422位点磷酸化。图4B1和图4B2显示，单独给予地昔帕明预处理组与正常对照组相比，tau蛋白Ser422位点磷酸化无变化，且p-MKK4和p-JNK水平也不改变；但与CA处理组相比，地昔帕明5，10和 20 μmol·L－1均显著降低CA诱导的MKK4磷酸化、JNK磷酸化和tau蛋白Ser422位点磷酸化水平，且其抑制MKK4磷酸化的效应呈浓度依赖性(r＝0.99，P＜0.01)。表明MKK4/JNK信号途径激活参与CA诱导的tau蛋白过度磷酸化。

Fig.4 Effect of CA on inhibiting MKK4/JNK transduction pathway on tau phosphoryIation at Ser422 site. A1.Lane 1:DMSO；lane 2:SP600125(40 μmol·L－1)；lane 3: CA 5 nmol·L－1，12 h，lanes 4－7；CA 5 nmo·lL－1treated for 12 h after SP600125 5，10，20，40 μmol·L－1pretreated for 2 h，respectively.B1.Lane 1:DMSO；lane 2:desipramine 20 μmol·L－1，lane 3:CA 5 nmol·L－1，12 h；lanes 4－6:CA 5 nmol·L－1treated for 12 h after desipramine 5，10，20 μmol·L－1pretreated for 2 h，respectively.A2 and B2 are the quantitative analysis of A1 and B1，respectively.n＝5.∗∗P＜0.01，compared with control group；＃＃P＜0.01，compared with CA group.

3 讨论

最近有报道预先腹腔注射褪黑素9 d可预防CA诱导的突触素(synaptophysin)丢失和记忆保持障碍，及tau蛋白过度磷酸化[7]。AD患者脑皮质突触富含Ser422位点过度磷酸化的tau蛋白，降低Ser422过度磷酸化的tau蛋白可显著改善转tau小鼠的记忆障碍[3]。本研究发现，CA处理显著升高Ser422位点磷酸化水平，褪黑素50 μmol·L－1对CA诱导的tau蛋白Ser422过度磷酸化的保护作用最强。这说明褪黑素可抑制CA诱导的tau蛋白Ser422位点过度磷酸化。

脂质过氧化产物丙烯醛可激活p38MAPK使tau蛋白在PHF-1识别位点发生过度磷酸化[11]，而CA可引起氧化应激[6]。因此，推测CA可能在细胞内引起氧化应激和脂质过氧化使p38MAPK激活。与此一致的是，本研究发现CA引起细胞内MDA水平升高，且褪黑素教Vit E更显著地降低CA引起的MDA水平升高。然而，p38MAPK活性检测却发现CA不引起p38MAPK激活和蛋白水平改变。免疫印迹和免疫荧光检测发现CA显著增加p-JNK水平，并且p-JNK显著聚集在核内。这与报道慢性抑制PP-2A可诱导JNK信号途径的活化一致[12]。根据MKK4是调节Ser422位点磷酸化的关键激酶和JNK信号转导途径激活的关键成分[13－14]，环境毒物甲基汞可使大脑皮质神经元发生氧化应激和通过激活MKK4和JNK引起小鼠大脑皮质tau蛋白在Thr-205，Ser-396和Ser-422位点磷酸化水平增加[15－16]，推测CA可能是通过氧化应激激活MKK4引起JNK磷酸化增加导致tau蛋白Ser422位点过度磷酸化。结果发现CA确实引起细胞内磷酸化MKK4水平显著升高，褪黑素和Vit E降低细胞内磷酸化MKK4水平。这说明MKK4激活可能参与CA诱导的JNK磷酸化激活和tau过度磷酸化。JNK的特异性抑制剂SP600125和神经鞘磷脂酶抑制剂地昔帕明单独处理并不改变tau蛋白Ser422位点磷酸化水平，但SP600125处理后再用CA处理，或地昔帕明处理后再给予CA处理，二者均浓度依赖性地抑制CA诱导的JNK磷酸化和tau蛋白Ser422位点的过度磷酸化，地昔帕明还抑制CA诱导的MKK4和JNK磷酸化，这证明MKK4/JNK信号途径激活参与CA诱导的tau蛋白Ser422位点过度磷酸化。

本研究发现，褪黑素可显著对抗CA引起的与记忆密切相关的tau蛋白Ser422位点磷酸化水平升高，这与报道，褪黑素可减轻CA引起的tau蛋白过度磷酸化，突触丢失和记忆障碍抑制及氧化应激一致[17]。根据报道，褪黑素可通过其MT1和MT2受体抑制过氧化氢、谷氨酸和TNF诱导的运动神经元凋亡和p38MAPK和JNK1的磷酸化[18]。因此，褪黑素也可能通过结合N2a细胞上的MT1受体抑制CA诱导的JNK磷酸化参与其预防CA诱导的tau蛋白Ser422位点过度磷酸化，因而不对JNK磷酸化产生过度抑制。因为磷脂酰肌醇3激酶和(或)蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号途径激活可负性调节JNK信号途径[19]，而褪黑素可持续增加Akt的磷酸化激活Akt信号途径[20]。因此，褪黑素也可能通过激活Akt抑制JNK信号途径激活。

总之，本研究首次证明褪黑素对CA诱导的tau蛋白Ser422位点磷酸化过度增强有抑制作用，并证明褪黑素对抗CA诱导的MKK4和JNK磷酸化参与其对tau蛋白过度磷酸化和改善记忆障碍的机制。

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Inhibiton of JNK phosphoryIation invoIved in meIatonin′s protection of caIycuIin A-induced tau hyperphosphoryIation

LI Xia-chun1，WANG Zhi-qiang1，LIU Xiu-ping2
(1.Department of Pathophysiology，Medical School of Three Gorge University，Yichang 443002，China；2.Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou310007，China)

OBJECTIVE To explore the mechanisms of tau hyperphosphorylation induced by calyculin A(CA)in neuroblastoma cells and the effect of melatonin.METHODS N2a cells were treated with CA 5 nmol·L－1，or CA with melatonin 50 μmol·L－1，or CA with vitamin E(Vit E)50 μmol·L－1for 12 h.The level of tau phosphorylation at Ser422(recognized by R145d antibody)site and the level of phosphorylated c-Jun N-terminal kinases(p-JNK)and phosphorylated mitogen-activated protein kinase kinase 4(p-MKK4)were detected with immunoblotting，the level of malondialdehyde(MDA)was assayed with fluorimetry，and the activity of p38-mitogen activated protein kinase(p38MAPK)was assayed by radioimmunobloting.RESULTS CA treatment increased the level of phosphorylated tau at Ser422 site(1.70±0.19，1.0，P＜0.01)，and melatonin attenuated the effect of CA(0.98±0.12，1.70± 0.19，P＜0.01).In addition，CA treatment increased the level of MDA(μmol·g－1protein:0.241±0.006，0.141±0.006，P＜0.01)and melatonin antagonized the increase of MDA induced by CA(μmol·g－1protein:0.172±0.004，0.193±0.005，0.241±0.006，P＜0.01).CA treatment increased the level of p-JNK (1.91±0.27，1，P＜0.01)and p-MKK4(1.81±0.09，1，P＜0.01)and melatonin antagonized the effect of CA induced increase of p-JNK(1.11±0.15，1.91±0.27，P＜0.01)and p-MKK4(1.14±0.06，1.81±0.09，P＜0.01)without changing the level or activity of p38MAPK.Both JNK inhibitor(SP600125)and MKK4/JNK transduction pathway inhibitor antagonized CA induced tau phosphorylation at Ser422 site and JNK phosphorylation.CONCLUSION Inhibiton of JNK phosphorylation is possibly involved in the protection of melatonin on CA-induced tau hyperphosphorylation at Ser422 site.

melatonin；calyculin A；tau phosphorylation；mitogen-activated protein kinase kinase 4

LI Xia-Chun，E-mail:lixiachun429＠aliyun.com，Tel:(0717)6397466

R963

:A

:1000-3002(2014)06-0830-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.003

2013-12-19 接受日期:2014-07-20)

(本文编辑:乔 虹)

李夏春，博士，副教授，主要从事阿尔茨海默病的发病机制研究。

李夏春，E-mail:lixiachun429＠aliyun.com，Tel:(0717)6397466