量化构效关系研究方法及其在金属纳米材料毒性研究中的应用进展

应佳丽，张 婷，唐 萌

(环境医学工程教育部重点实验室，东南大学公共卫生学院，江苏省生物材料与器件重点实验室，江苏南京 210009)

量化构效关系研究方法及其在金属纳米材料毒性研究中的应用进展

应佳丽，张 婷，唐 萌

(环境医学工程教育部重点实验室，东南大学公共卫生学院，江苏省生物材料与器件重点实验室，江苏南京 210009)

量化构效关系(QSAR)是用来预测单一系列化合物结构和效应关系的方法,近年来逐渐应用于纳米材料毒性高通量筛选和预测。本文结合传统QSAR研究方法以及金属纳米材料结构和毒性特点,探讨目前金属纳米材料QSAR研究方法,主要针对仪器测量和量子化学等结构描述符获取方法,金属纳米材料毒理学实验数据质量评定标准,支持向量机、人工神经网络等模型构建方法,留一法、留多法等模型验证方法的研究进展及所面临的研究难点进行了综述,并对该领域的进一步研究进行了展望。

毒理学；纳米结构；量化构效关系；金属纳米粒子

随着纳米技术发展，小尺度、特殊结构和理化性质的纳米尺寸材料在越来越多领域被应用。目前已知＞1000种经鉴定依赖于纳米技术的消费品被应用于市场，学者们逐渐意识到全面评价纳米材料安全性及其生物效应信息对大规模安全使用纳米材料的重要性。面对数量巨大且不断增加的新型纳米材料，要对它们一一进行毒性评价需要花费大量的人力、物力、财力，因此亟待建立一套快速高通量的方法来预测和评价纳米材料潜在毒性[1]。

将毒理学、系统生物学、生物统计学、计算机科学等学科交叉，应运而生的计算毒理学通过用数学及计算机模型来预测、阐明化合物的毒性效应及作用机制，可有效提高研究者估测人体暴露于某种毒物的相关风险或结果的能力。其中量化构效关系(quantitative structure-activity relationship，QSAR)是计算毒理学的主要研究领域，它利用理论计算和统计分析工具，借助结构参数，构建数学模型，描述与研究单一系列化合物结构与效应之间的定量关系，可定量研究化合物分子与生物大分子相互作用，化合物分子在生物体内吸收、分布、代谢、排泄，预测化合物的毒性与机制。目前，已经有研究者将QSAR运用到纳米材料的毒性预测方面，例如Puzyn等[2]把应用于纳米材料的QSAR研究方法称为纳米量化构效关系(nano-QSAR)，Fourches等[3]则把其称为量化纳米构效关系(quantitative nanostructure activity relationship，QNAR)。

纳米材料根据材料性质不同，可分为金属纳米材料、无机纳米材料、有机纳米材料，其中，金属纳米材料是指三维空间中至少有一维处于纳米尺度或由它们作为基本单元构成的金属材料。金属纳米材料作为纳米材料中使用最广泛的类别之一，广泛应用于生物、医药、物理和化学等领域，同时其对人体的危害也不容忽视，因此，对金属纳米材料进行QSAR研究显得尤为重要。本文结合传统QSAR的研究方法，通过结构描述符(descriptor)选择、效应终点描述符选择、模型构建、模型验证与评价方面综述了金属纳米材料QSAR研究的实现。

1 金属纳米材料QSAR关系研究的实现

传统的QSAR研究方法已经日益成熟，方法多样，但金属纳米材料QSAR研究与传统QSAR研究有许多不同，主要在于结构描述符的选择上，例如，①在选择结构描述符时，金属纳米材料QSAR研究除了要研究其构成的化学物的物理化学性质，如辛醇水分配系数、相对分子质量、化学结构等，还需要考虑金属纳米材料本身的结构特征，如尺寸、形状等因素；②传统QSAR的研究对象主要是有机化合物，金属纳米材料QSAR研究的对象属于无机物范畴，目前对于无机物的描述符研究还较少，如热力学描述符[4]。虽然金属纳米材料的QSAR研究面临着巨大的挑战，但近年来，已经有人成功地构建了金属纳米材料的QSAR模型，如Epa等[5]用109种金属纳米材料构建了人脐静脉内皮细胞和PaCa2细胞的细胞摄取纳米颗粒量QNAR模型，用31种金属纳米材料构建了平滑肌细胞凋亡率QNAR模型；Pathakoti等[6]用17种金属纳米材料构建了关于大肠杆菌光毒性的QNAR模型；Puzyn等[4]用17种金属纳米材料构建了大肠杆菌半数抑制率QNAR模型，之后Toropov等[7]又在此数据的基础上采用不同方法选取结构描述符构建了一个大肠杆菌半数抑制率QNAR模型。

2 结构描述符的选择

金属纳米材料QSAR研究在结构描述符的选取上可以参考传统QSAR研究方法。传统QSAR研究的结构描述符主要分为两类:经验描述符和理论计算描述符，对于金属纳米材料QSAR模型而言，经验描述符主要包括粒径、表面性质、形状、zeta电位等，理论计算描述符主要包括组成描述符、拓扑几何描述符、电荷相关描述符以及量子化学描述符[8]。

2.1 金属纳米材料的毒性

由于金属纳米材料结构的复杂性，如何选择金属纳米材料的结构描述符是目前金属纳米材料QSAR研究最重要也是最困难的部分，描述符选取的优劣也直接影响到模型的预测效率。目前可以描述金属纳米材料结构的描述符有＞1000种，但很难将其全部量化，因此，我们需要选取那些可量化的毒性相关描述符作为构建QSAR模型的候选结构描述符。研究表明，金属纳米材料的毒性效应与其自身的某些物理化学性质紧密相关[9]，鉴于此，对毒性产生影响的理化参数，包括尺寸、形状、表面电荷、化学组成、表面修饰、金属杂质、团聚与分散性以及降解性能等[10]也是描述符选择的对象。同时，由于纳米材料较大的比表面积和较高的表面能，一旦接触生理环境，将会迅速吸附一系列的蛋白质，即形成所谓的“蛋白冠”，故“蛋白冠”的形成也可能会影响纳米材料对生物体的毒性[11]，用分子探针表征的纳米材料表面吸附系数可将其量化[12]。

2.2 结构描述符的获取方法

在选取了结构描述符后，如何通过各种方法对其定量描述是结构描述符选择环节的重要步骤。结构描述符主要通过两种途径获取，一方面，直接通过仪器测量，如通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)获得尺寸、粒径、表面积等，通过马尔文粒度仪测量zeta电位等；另一方面，对于一些理论计算描述符，比如轨道能量、轨道电子密度、形状等则需要通过量子化学、拓扑学等方法获得。Damoiseaux等[13]概括总结了人造纳米材料结构表征及其分析工具，如:① 对于原始形态和结构的纳米材料，可以采用投射电子显微镜(TEM)，扫描电子显微镜(SEM)，原子力显微镜(AFM)，环境扫描电镜(ESEM)，聚焦离子/电子双束显微电镜(FIB-SEM)，冷冻投射电镜(cryo-TEM)测量其原始粒径，形态及分布；采用TEM，小角X射线散射(SAXS)，小角中子散射(SANS)方法测量其分形结构；采用比表面测定仪(BET)，SAXS，SANS测量空隙大小、多孔性和表面积；采用X射线衍射仪(XRD)，梭曼(Raman)光谱，SAXS，核磁共振波谱法(NMR)测量结晶度、框架结构和晶体尺寸；用Raman，NMR，X-射线谱仪(EDAX)，傅氏转换红外线光谱分析仪(FTIR)，X射线光电子能谱仪(XPS)，电感耦合等离子体质谱仪(ICP)测量化学组成；采用Raman，X射线吸收精细结构(XAFS)，X射线吸收近边结构(XANES)，NMR测量元素种类，氧化状态；采用SAXS，Mossbauer Mossbauer谱线，ESR等效串联电阻，Raman，UV-Vis测量电性、磁性及光学性能；采用SMPS测量含尘量及形成气溶胶的能力。② 对于分散在溶剂中的纳米材料，则可以采用DLS，SMPS，激光衍射测量其分散粒径，粒径分布；通过在不同的悬浮液中直接滴定测量电荷密度、pKa、PZC、电离分数；通过多个液体探针接触的角测量测量其表面张力单元；采用AFM，FTIR，XPS，NMR，Raman测量粗糙度和化学异质性。

由于金属纳米材料属于无机化学物范畴，还可考虑有关化学稳定性的热力学常数[4]、和有关细胞膜破坏和细胞吞噬的静电干扰结构描述符[12]等。除此之外，鉴于金属纳米材料结构的复杂性，可以采取一些方法来简化，如Shaw等[14]研究表明，51种具有相同内核和不同表面修饰的金属纳米材料其毒性主要受表面修饰影响。因此，可以只选择有关其表面修饰功能基团的结构描述符。

目前，有许多可以用于计算结构描述符的软件，如DRAGON，MOPAC，AMPAC和GAUSSIAN等软件。Puzyn等[4]运用MOPAC软件并采用PM6半经验方法计算了17种金属纳米材料的结构参数，最终获得了较为理想的模型。

3 效应终点描述符的选择

一个预测性好的QSAR模型的建立还需要高质量的效应终点数据。根据金属纳米材料作用生物体的不同，作用对象分为细胞、动物和细菌3大类。传统QSAR研究中常选的效应终点描述符包括细胞半数致死浓度、细胞半数抑制浓度、对小鼠的半数致死量等可以定量的效应参数。这些效应描述符同样可以用于金属纳米材料的效应终点。除了通过实验获得所需要的效应参数，还可以通过检索文献获取。目前已有大量关于金属纳米材料毒性的文献，如Falugi等[15]报道了效应参数为 HSC70和GRP78含量的金属纳米材料体外毒性实验，Tong等[16]报道了效应参数为半数抑制浓度的金属纳米材料细菌毒性实验，Arulvasu等[17]报道了效应参数为半数致死浓度的金属纳米材料体内毒性实验。除此之外，美国智能自动化有限公司(Intelligent Automation.Inc)开发了一套研究纳米材料环境影响数据挖掘系统(nanomaterial environmental impact eata miner，NEIMiner)，为金属纳米材料QSAR研究提供了一定的技术支持。由于构建金属纳米材料QSAR模型的最终目的是准确预测金属纳米材料毒性并指导金属纳米材料的合成，但文献中的数据并不是都可以用于构建预测性强的QNAR模型，Lubinski等[18]根据Klimisch等[19]关于评估化合物毒性实验数据的标准，制定了评估纳米材料实验数据的标准。

4 模型的构建

当获取了结构描述符和效应描述符后，如何在两者之间建立联系，运用已知的结构参数预测可能出现的毒性或生物效应就需要进行模型构建。一种金属纳米材料可以有多个描述符，这些描述符可以作为模型中的变量，但这些变量对于构建数学模型的重要性是不等同的，所以需要剔除非显著性变量。变量过多不仅计算量大，而且对构建比较稳定的数学模型不利。通过运用主成分分析、因子分析、遗传算法、模拟退火、最优子集选择法进行变量筛选后，将这些筛选出来的变量纳入模型[20]。模型包括线性模型和非线性模型，对于相同的数据集采用不同的建模方法，都可以获得合格的QNAR模型，如对于相同的数据来源，Fourches等[21]分别用支持向量机(SVM)，方法构建了外部预测能力为75%的QNAR模型和用邻近算法(KNN)构建了平均外部拟合相关系数为0.72的QNAR模型，而Epa等[5]用非线性神经网络方法构建了训练集相关系数为0.80，测试集回归系数为0.90，估计标准误(SEE)为2.8，外部预测能力(SEP)为2.9的QNAR模型。故在构建金属纳米材料QNAR模型时，应结合数据特征尝试不同的建模方法，直到选出最优模型。

5 模型的验证与评价

一个合格的QNAR模型需遵循经合发展组织(OECD)相关规定[22－23]，因此还需对构建完成的QNAR模型进行验证，验证是确保模型预测效率的前提。模型的验证包括内部验证和外部验证。内部检验用来评价模型的内部预测能力和稳健性，外部检验用来评价模型的外部预测能力。模型内部验证方法包括留一法交叉验证，留多法或留N法交叉验证，y随机化验证和自举法。模型外部验证可通过计算统计量、CCC一致性相关系数及rm2或通过Golbraikh和Tropsha等方法[23]。在之前发表的有些金属纳米材料QSAR文献并没有进行严格的验证，如Pyzun等[4]对17种金属纳米材料的毒性预测的模型只进行了内部验证而未进行外部验证，这样的模型外部预测能力未知。对模型进行验证之后，还需对模型的验证结果进行评价。一般来说一个好的QSAR模型需具备较高的估计相关系数(R2＞0.6)和较低的标准偏差(q2＞0.6)。最后对建立的QNAR模型还需有定义域，阐述模型所适用的范围[24]。

综上所述，金属纳米材料的QSAR研究步骤如即通过实验，数据挖掘及理论计算获得金属纳米材料效应参数和结构参数，将效应参数和结构参数构建成一个数据集，再将数据集分成训练集和测试集，训练集用于模型构建，测试集用于模型验证，并给出定义域。

图1 金属纳米材料QSAR研究步骤.常用的外部验证为用测试集中的子集进行验证.

6 展望

尽管QSAR已经发展了很多年，方法日益丰富，但包括金属纳米材料QSAR在内的QNAR研究还是一个年轻的研究方向，对于金属纳米材料而言，由于材料的复杂性，给金属纳米材料QSAR研究带来了许多困难与挑战。①由于金属纳米材料结构的复杂性，我们在考虑其结构描述符时，不但要考虑其所含化学物，还得考虑尺寸，形状，多孔性等特征；②金属纳米材料的QSAR研究的主要是无机物，而目前QSAR研究的主要是有机物，用于无机物描述符的研究还较少；③虽然有金属纳米材料毒性效应相关的数据库，但还不完善，数据的收集过程困难较大；④但愿能有更多的关于金属纳米材料毒性机制的研究，以建立解释性更好的金属纳米材料的QNAR模型。

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QSAR method and its appIication to toxicity prediction of metaI nanomateriaIs

YING Jia-li，ZHANG Ting，TANG Meng
(Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering，Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices，School of Public Health，Southeast University，Nanjing 210009，China)

Quantitative structure activity relationship(QSAR)study attempts to correlate chemical structure with activity using statistical approaches and is now being applied to high throughput toxicity screening and prediction of nanomaterials.This paper is interded to discuss the present QSAR study methods of nanomaterials based on traditional QSAR study，such as the use of measurement instrument and quantum chemistry methods of structure descriptor selection，evaluation criteria for the quality of published experimental data on nanomaterials，modeling methods such as K-nearest neighbor(KNN) and support vector machine(SVM)，validation methods such as leave-one-out(LOO)and leave-N-out (LNO).We also review the problems and challenges existing in this area and predict future development.

toxicology；nanostructures；quantitative structure-activity relationship；metal nanoparticles

s:ZHANG Ting，E-mail:zhangting1207＠gmail.com；TANG Meng，E-mail:tm＠seu.edu.cn，Tel:(025)83272564

R114，TB383

:A

:1000-3002(2014)06-0947-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.019

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(81172697)；National Natural Science Foundation of China(81302461)；National Important Project on Scientific Research of China (2011CB933404)；Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education(20110092110041)；Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education(20130092120062)

2014-03-10 接受日期:2014-05-10)

(本文编辑:乔 虹)

国家自然科学基金(81172697)；国家自然科学基金(81302461)；国家重大研究计划(2011CB933404)；高等学校博士点基金(20110092110041)；高等学校博士点基金(20130092120062)

应佳丽(1989－)，硕士研究生，主要从事卫生毒理学研究；唐 萌(1958－)，教授，主要从事卫生毒理学研究。

张 婷，E-mail:zhangting1207＠gmail.com；唐 萌，E-mail:tm＠seu.edu.cn，Tel:(025)83272564