RASSF2基因甲基化与卵巢透明细胞癌的相关性

任芳，王丹波

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳110004）

RASSF2基因甲基化与卵巢透明细胞癌的相关性

任芳，王丹波

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳110004）

目的探讨RASSF2基因异常甲基化与卵巢透明细胞癌的相关性。方法分别通过甲基化特异性PCR技术及免疫组化技术检测48例卵巢透明细胞癌组织中RASSF2基因的甲基化及蛋白表达情况。结果透明细胞癌组织中RASSF2基因的甲基化发生率（45.83%，22/48）及蛋白表达缺失发生率（47.92%，23/48）均显著高于正常卵巢组织及癌旁异位内膜组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。RASSF2基因甲基化与其蛋白表达缺失具有相关性。结论RASSF2基因异常甲基化所导致的蛋白表达缺失可能在卵巢透明细胞癌的发病机制中具有重要作用。

卵巢透明细胞癌；RASSF2；甲基化

卵巢透明细胞癌是卵巢上皮性癌的一种，占全部卵巢上皮性癌的5%～11%。由于卵巢透明细胞癌术后残留肿瘤对化疗药物反应性低，与其他类型卵巢上皮癌相比，卵巢透明细胞癌患者预后较差。因此，系统研究透明细胞癌的发病机制，实现对卵巢透明细胞癌的早期诊断和治疗，甚至实现对其发病高危人群进行筛查，将会明显改善其预后。然而目前卵巢透明细胞癌的发病机制尚不清楚。基因启动子区域的甲基化是导致基因表达沉默的一种重要表观遗传机制。研究表明，基因的异常甲基化是肿瘤发生过程的早期事件。同时在多种肿瘤中，DNA异常甲基化模式具有肿瘤特异性，以基因异常甲基化作为生物标记，不仅可以用于对疾病进行早期诊断及预后评估，还可用于对高危人群的检测和评估。RASSF2基因是新近发现的一种抑癌基因，该基因的异常甲基化在多种肿瘤的发生过程中具有重要的作用，而该基因异常甲基化与卵巢透明细胞癌的相关性尚未见文献报道。本研究旨在通过检测RASSF2基因在卵巢透明细胞癌组织中的甲基化及蛋白表达情况，探索RASSF2基因表观失活与卵巢透明细胞癌的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本来源及组织获取

收集2008年1月至2012年1月于中国医科大学附属盛京医院妇产科因卵巢透明细胞癌行手术治疗患者的石蜡包埋标本48例作为实验组，其中Ⅰ期28例，Ⅱ期12例，Ⅲ期8例，患者平均年龄为（50.38±7.63）岁。选取其中单侧透明细胞癌病例对侧正常卵巢组织20例作为对照组。石蜡组织连续切片10 μm，获取对应透明细胞癌组织及正常卵巢组织。同时所有入组卵巢透明细胞癌病例经妇科病理专家根据Sampson［1］及Scott［2］提出的子宫内膜异位症（内异症）恶变诊断标准进一步阅片，确认其中12例符合卵巢内异症恶变诊断标准，为卵巢内异症恶变病例，另36例为原发卵巢透明细胞癌病例。在切割显微镜下用刀片或针头对靶组织进行显微切割。收集12例内异症恶变来源的透明细胞癌石蜡标本所对应的癌旁异位内膜组织8例（另4例因异位内膜组织数量少，未行后续检测）。以上组织的采集均得到患者本人或家属知情授权及中国医科大学医学伦理委员会的同意。

1.2 甲基化特异性PCR检测组织中RASSF2基因的甲基化情况

按试剂盒说明采用德国QIAGEN公司试剂盒提取各组织基因组DNA。获取的各组织基因组DNA经亚硫酸氢钠在55℃孵育16 h后经美国Promega公司Wizard Clean-up系统纯化。经NaOH终止修饰后，修饰后的基因组DNA重悬于双蒸水中。在修饰过程中以经过足量美国NEB公司SssⅠ甲基转移酶处理的正常人外周血淋巴细胞基因组DNA作为阳性对照，以PBS代替SssⅠ甲基转移酶处理作为阴性对照。修饰后DNA经RASSF2甲基化及非甲基化特异性引物进行扩增，引物序列：RASSF2MF：5′-GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG-3′，RASSF2MR：5′-AAAAACCAACGACCCCCGCG-3′（148 bp），RASSF2UF：5′-AGTTTGTTGTTGTTTTTTAGGTGG-3′，RASSF2UR：5′-AAAAAACCAACAACCCCCACA-3′（154 bp），扩增产物经琼脂糖电泳后，紫外灯下观察结果。

1.3 免疫组化技术检测组织中RASSF2蛋白表达情况

通过免疫组化SP法结合DAB显色检测各组织中RASSF2蛋白表达，具体步骤参照文献［3］。一抗RASSF2山羊抗人多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）以1∶100稀释，以PBS替代一抗作为阴性对照及试剂盒附带阳性对照作为阳性对照。RASSF2蛋白正常表达于细胞质，免疫组织化学结果判定由2人在双盲的情况下进行光学显微镜观察，按阳性细胞百分比及阳性细胞染色强度评分，HIS=a×b。a代表阳性细胞的百分比对应的评分：a=0，无阳性细胞显色；a=1，阳性细胞显色数＜10%；a=2，阳性细胞显色数10%～50%；a=3，阳性细胞显色数＞50%。b代表阳性细胞染色强度：b=0，不显色；b=1，浅黄色；b=2，棕黄色；b=3，深黄色。判定标准：HIS 0～3分为阴性；HIS 4～9分为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS13.0软件，采用χ2检验及Fisher确切概率法比较各组RASSF2基因甲基化差异及RASSF2基因甲基化与其蛋白表达缺失的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组织中基因RASSF2异常甲基化情况

通过甲基化特异性PCR技术检测各个组织中RASSF2基因的甲基化情况（图1），结果表明，12例内异症恶变相关卵巢透明细胞癌组织中RASSF2基因甲基化发生率为58.33%（7/12），36例非病理证实恶变来源的卵巢透明细胞癌组织中RASSF2基因甲基化发生率为41.67%（15/36），8例癌旁异位内膜组织中仅有1例检测到该基因的异常高甲基化，正常卵巢组织中均未检测到该基因的异常甲基化。2种起源卵巢透明细胞癌组织中RASSF2基因甲基化发生率均显著高于正常卵巢组织及异位内膜组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；2种来源卵巢透明细胞癌组织比较RASSF2基因甲基化发生率无统计学差异（P＞0.05）。

图1 卵巢透明细胞癌中RASSF2甲基化特异性PCR结果Fig.1 Methylation⁃specific PCR of RASSF2in the tissue of ovarian clear cell cancer

2.2 各组织中RASSF2蛋白表达情况

通过免疫组化技术检测各个组织中RASSF2蛋白表达情况（图2），RASSF2蛋白主要表达于细胞质。48例卵巢透明细胞癌组织中RASSF2蛋白表达缺失发生率为47.92%（23/48），而20例正常卵巢组织中均检测到RASSF2蛋白正常表达，8例癌旁异位内膜组织中有1例检测到该蛋白表达缺失。该结果表明，卵巢透明细胞癌组织中RASSF2蛋白表达缺失率显著高于正常卵巢组织及癌旁异位内膜组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。同时，获取的全部76例组织（卵巢透明细胞癌48例，异位内膜8例，正常卵巢组织20例）中，发生RASSF2基因甲基化组织23例，其中有22例检测到RASSF2蛋白表达缺失。RASSF2基因非甲基化组织53例，其中仅有2例检测到RASSF2蛋白表达缺失，RASSF2基因的异常甲基化与该基因蛋白表达缺失具有相关性（P＜0.05）。

图2 卵巢透明细胞癌组织中免疫组化染色检测RASSF2蛋白表达情况S⁃P法×200Fig.2 RASSF2 protein expression in the tissue of clear cell ovarian carcinoma by immunohistochemistry S⁃P×200

3 讨论

卵巢透明细胞癌于1973年被世界卫生组织正式作为一个独立的亚型归类为卵巢上皮性肿瘤。由于卵巢透明细胞癌增殖能力较低、对化疗药物易产生耐药性等原因，与其他上皮性癌相比预后不良。既往观点认为卵巢透明细胞癌的来源有两种，一种是来源于卵巢内异症恶变，另一种认为其主要来源于苗勒氏管。而近年来关于卵巢癌发生机制的“二元发病模型”学说［4］值得关注，“二元发病模型”的核心为卵巢癌外起源学说，该学说认为卵巢癌来自于卵巢外的种植，即浆液性腺癌来自输卵管伞端黏膜上皮的病变，子宫内膜样和透明细胞肿瘤来自异位的子宫内膜，黏液性和移行细胞肿瘤则有可能来自卵巢旁Wathard细胞巢，这一假说已经得到一些基础研究证实。由此，卵巢透明细胞癌系内异症起源已被多数学者所接受［5］。

本研究入选的48例卵巢透明细胞癌病例中，有12例根据病理所见确诊为卵巢内异症恶变相关性卵巢透明细胞癌，其余36例未得到恶变诊断的病理证实，该结果似乎与卵巢癌外起源学说相悖，分析该现象的原因可能为内异症恶变有着严格的病理诊断标准，由于恶变后生长旺盛的肿瘤组织破坏了起源组织，同时由于内异症具有病理变化多态性的特点，以致找不到内异症恶变的组织学依据；另外，病理取材的局限性（病理取材只有大体标本的2%或1%），漏诊了同时存在的内异症，而未能病理证实全部卵巢透明细胞癌为内异症恶变来源。本研究分别检测2种不同来源卵巢透明细胞癌组织中RASSF2基因甲基化情况后发现，内异症恶变相关性卵巢透明细胞癌组织中，RASSF2基因甲基化发生率与非病理证实恶变的卵巢透明细胞癌组织中该基因的甲基化发生率无统计学差异，该结果也进一步支持2组卵巢透明细胞癌可能同为卵巢内异症恶变来源这一观点。

RASSF2基因是Ras相关结构域家族成员，该基因编码的蛋白含有Ras作用域，能够能通过该Ras作用域以GTP依赖的方式与K-Ras作用，是Ras基因的负效应子，作为一种抑癌基因在Ras信号传导通路上起到重要的枢纽作用［6］。RASSF2在人体内广泛表达，在多种原发性恶性肿瘤及肿瘤细胞系中发现了由于异常甲基化所导致的RASSF2基因的表达下调［7，8］。本研究表明，卵巢透明细胞癌组织中RASSF2基因的甲基化发生率显著升高，蛋白表达明显下降，表明RASSF2基因异常甲基化所导致的蛋白表达缺失可能在卵巢透明细胞癌的发病机制中具有重要作用。

Akino等［9］研究发现，RASSF2基因的表观的失活能够增强K-Ras基因介导的致癌性转化。同时，在胃癌相关研究也中发现，RASSF2基因下调可能通过直接或间接激活Ras基因通路而抑制细胞凋亡、促进炎性反应及促进血管生成，进而在肿瘤形成过程中发挥重要作用［10］。Otsuka等［11］认为，Ras基因的异常激活导致其表达上调在卵巢内异症恶变为卵巢透明细胞癌的过程中发挥重要作用，而RASSF2基因作为Ras信号传导通路的负性调控子［12，13］，是否通过其异常甲基化调控Ras信号传导通路而在卵巢透明细胞癌的发生过程中发挥重要作用尚待进一步证实，这也将是本研究后续需要进行研究的课题内容之一。

本研究发现，卵巢透明细胞癌中RASSF2基因的异常甲基化发生率及其所导致的蛋白表达缺失率显著增加，提示RASSF2基因异常甲基化所导致的蛋白表达失活可能与卵巢透明细胞癌的发生相关，后续有待于进一步深入研究其在卵巢透明细胞癌发生过程中的作用机制。

［1］Sampson JA.Endometrial carcinoma of the ovary，arising in endometrial tissue in that organ［J］.Arch Surg，1925，10：1-72.

［2］Scott RB.Malignant changes in endometriosis［J］.Obstet Gynecol，1953，2（3）：283-289.

［3］王劲欧，吕庆杰，姜卫国，等.B7-H4在卵巢癌的表达及意义［J］.中国医科大学学报，2009，38（4）：299-301.

［4］孔北华.重视卵巢癌的二元论模型与卵巢外起源新说［J］.中华妇产科杂志，2011，46（10）：721-724.

［5］Veras E，Mao TL，Ayhan A，et al.Cystic and adenofibromatous clear cell carcinomas of the ovary：distinctive tumors that differ in their pathogenesis and behavior：a clinicopathologic analysis of 122 cases［J］.Am J Surg Pathol，2009，33（6）：844-853.

［6］Vos MD，Ellis CA，Elam C，et al.RASSF2 is a novel K-Ras-specific effector and potential tumor suppressor［J］.J Biol Chem，2003，278（30）：28045-28051.

［7］Schagdarsurengin U，Richter AM，Hornung J，et al.Frequent epigenetic inactivation of RASSF2 in thyroid cancer and functional consequences［J］.Mol Cancer，2010，9：264.

［8］Guerrero-Setas D1，Pérez-Janices N，Blanco-Fernandez L，et al. RASSF2 hypermethylation is present and related to shorter survival in squamous cervical cancer［J］.Mod Pathol，2013，26（8）：1111-1122.

［9］Akino K，Toyota M，Suzuki H，et al.The Ras effector RASSF2 is a novel tumor-suppressor gene in human colorectal cancer［J］.Gastroenterology，2005，129（1）：156-169.

［10］Maruyama R，Akino K，Toyota M，et al.Cytoplasmic RASSF2A is a proapoptotic mediator whose expression is epigenetically silenced in gastric cancer［J］.Carcinogenesis，2008，29（7）：1312-1318.

［11］Otsuka J，Okuda T，Sekizawa A，et al.K-ras mutation may promote carcinogenesis of endometriosis leading to ovarian clear cell carcinoma［J］.Med Electron Microsc，2004，37（3）：188-192.

［12］Donninger H，Hesson L，Vos M，et al.The Ras effector RASSF2 controls the PAR-4 tumor suppressor［J］.Mol Cell Biol，2010，30（11）：2608-2620.

［13］Park HW，Kang HC，Kim IJ，et al.Correlation between hypermethylation of the RASSF2A promoter and K-ras/BRAF mutations in microsatellite-stable colorectal cancers［J］.Int J Cancer，2007，120（1）：7-12.

（编辑 陈姜）

Investigation on the Correlation between Hypermethylation of RASSF2and Clear CellOvarian Carcinoma

RENFang，WANGDan-bo
（DepartmentofObstetricsand Gynecology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the correlation between hypermethylation ofRASSF2and ovarian clear cell carcinoma.MethodsMethylation-specific PCR and immunohistochemistry were performed in 48 ovarian clear cell carcinoma samples to detect the methylation status and protein expression ofRASSF2，respectively.ResultsIn the ovarian clear cell carcinoma tissue，methylation frequency（45.83%，22/48）and absence of protein expression ofRASSF2（47.92%，23/48）was higherthan thatin both normalovarian tissue and ectopic endometria adjacentto the cancerous region，respectively（P＜0.05）.Absence of protein expression ofRASSF2was significantly correlated with the hypermethylation of the gene.Con⁃clusionEpigenetic inactivation ofRASSF2by promoterhypermethylation may be associated with the pathogenesis ofclearcellovarian carcinoma.

ovarian clear cell cancer；RASSF2；hypermethylation

R711.75

A

0258-4646（2014）11-0969-04

国家自然科学基金（81070467，30471816）；沈阳市科学技术计划（F14-231-55）

任芳（1981-），女，主治医师，博士.

王丹波，E-mail：wangdb@sj-hospital.org

2014-08-29

网络出版时间：