马奶酒样乳杆菌ZW 3在豇豆发酵中的应用

郑永娜，赵勇，王菁蕊，王艳萍，*

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457；2.天津市和平区南市街社区卫生服务中心，天津300457）

马奶酒样乳杆菌ZW 3在豇豆发酵中的应用

郑永娜1，赵勇2，王菁蕊1，王艳萍1，*

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457；2.天津市和平区南市街社区卫生服务中心，天津300457）

研究了马奶酒样乳杆菌ZW3以不同比例与植物乳杆菌299和乳酸菌723复配用于豇豆的发酵，在接种量一定的情况下，随着马奶酒样乳杆菌ZW3所占比例的增大，酸豆角的pH降低，酸度增加；以感官评分作为指标，确定3种菌以1∶1∶1比例复配发酵时，酸豆角口味最佳。通过有机酸与挥发性风味物质分析，结果显示以1∶1∶1比例接种发酵的酸豆角与自然发酵的酸豆角中的有机酸与挥发性风味物质在种类与含量上基本一致。将马奶酒样乳杆菌ZW 3用于发酵泡菜，泡菜pH值下降快、产酸率高、风味纯正。

马奶酒样乳杆菌ZW3；酸豆角；产酸；风味物质

豇豆含丰富VB、VC和植物蛋白质，具有多种功效，如《本草纲目》就有记载，“豇豆理中益气，补肾健胃，和五脏，调营卫，生精髓。止消渴，吐逆，泄痢，小便数，解鼠莽毒[1]。”在我国长豇豆种植分布面积广，全国各省市区均有种植[2]。豇豆的集中产出就会使其大量的积压，最终导致变质，不仅给农民造成了极大的损失，而且还造成大量的浪费。豇豆经乳酸菌发酵制成酸豆角可解决豇豆的闲置问题。酸豆角作为泡菜的一种，具有悠久的历史，其制作可以追溯到两千多年前[3]。酸豆角的酸味浓郁、口味醇厚、营养易于吸收，同时还具有开胃理气，降低胆固醇，控制皮肤老化及改善皮肤效果，抗癌，增强免疫力等功能特性[4]。

我国现阶段酸豆角的生产仍然以家庭式天然发酵为主[4]，乳酸发酵缓慢，发酵周期较长，酸味较弱，并且受环境因子影响也很大，产品质量不稳定，同时亚硝酸盐含量在很大程度上得不到有效的控制。这些不利因素很大程度上制约着酸豆角的工业化生产。纯乳酸菌接种已成为近些年发酵研究的重点，它在克服自然发酵不足的同时，也推动着泡菜的工业化发展[3]。所以，针对酸豆角工业化生产现状，筛选出产酸能力强，发酵特性优良的菌种极为重要。

本实验将新分离出的菌种——马奶酒样乳杆菌ZW3[5]用于酸豆角发酵，研究了其与其它乳酸菌混合发酵过程中，不同比例接种马奶酒样乳杆菌ZW 3对产酸的影响，以及含马奶酒样乳杆菌ZW3的发酵与自然发酵相比，有机酸，挥发性风味物质，感官上的差异，为酸豆角工业化生产提供技术依据与理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新鲜豇豆、白砂糖、食盐等均购于当地市场。

菌种：植物乳杆菌299（Lactobacillus plantaruM299）、乳酸菌723（Lactic acid bacteria 723）、马奶酒样乳杆菌ZW3（Lactobacillus kefiranofaciens ZW3），保藏于天津科技大学食品工程与生物技术学院食品生物技术实验室。

1.2 主要仪器与试剂

泡菜坛：天津市农贸市场；HFsafe900型超净工作台：上海力申科学仪器有限公司；全自动高压灭菌锅：日本Yamato公司；LRH-250生化培养箱：上海-恒科技有限公司；DY-2厌氧培养箱：浙江冷冻机总厂；DELTA-320 pH计：瑞士梅特勒-托利多公司；L710A型高效液相色谱仪：日本岛津公司；GC-MS-4000气相色谱-质谱联用仪：美国VARIAN公司。

MRS液体培养基[6]；改良MRS液体培养基：酵母粉45.0 g，葡糖糖16.0 g，乳糖4.0 g，NaCl0.15 g，K2HPO40.5 g，半胱氨酸盐酸盐1.4 g，乙酸钠15.0 g，Tween-80 1 g，MnSO40.2 g，蒸馏水定容至1 L，pH 6.2，115℃高压灭菌20min。

1.3 试验方法

1.3.1 泡菜的制作工艺

1.3.2 添加不同比例马奶酒样乳杆菌ZW3发酵实验

分别选取马奶酒样乳杆菌ZW3、植物乳杆菌299、乳酸菌723的比例为2∶1∶1、1∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2、0∶1∶1，即马奶酒样乳杆菌ZW3占发酵剂的比例分别1/2、1/3、1/ 4、1/4、0，按上述工艺进行发酵，同时以自然发酵作为对照。测定发酵酸豆角的pH、总酸，并对其进行感官评分。每组试验3组平行，试验结果为3组平行的平均值。

1.3.3 加入马奶酒样乳杆菌ZW 3的酸豆角与自然发酵酸豆角风味物质对比分析试验

根据1.3.2的试验结果，选取最佳菌种比实验组，对此实验组与达到相同酸度的自然发酵组的风味物质进行测定。

1.3.4 检测指标

1.3.4.1 pH及总酸的测定

使用pH计测定酸豆角发酵液的pH值；总酸的测定根据GB/T12356-2008中的规定，采用滴定法，以乳酸计。

1.3.4.2 感官评分

感官评分主要从样品的色泽、香气、质地与味道进行评分，感官指标要求及感官评分权重如表1所示。

表1 感官指标要求及感官评分权重[7]Table1 Indicators requirementsand evaluation criteria of the sensory

1.3.4 有机酸分析[8]

有机酸采用高效液相色谱（HPLC）进行测定与分析。

A．样品的预处理

酸豆角汁加入0.1%（w/v）的磷酸中，4℃条件下9 000 rpm离心10min，取上清过0.45μm滤膜，备用。

B．色谱条件

液相色谱仪：岛津L710A，色谱柱：VenusilMPC18（5μm，250×4.6mm），柱温25℃，使用0.1%（w/v）的磷酸作为流动相，流速为1.0mL/min，紫外检测波长210 nm，进样量10μL。

C．标准曲线的制作及样品的测定

准确称取有机酸标准品草酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、丙酸，溶解于0.1%（w/v）的磷酸溶液中。分别以不同浓度进样检测，测定不同标准品的出峰时间及其不同浓度对应的峰面积，制作标准曲线。

将预处理后的样品分别进行上机检测，采用外标法计算样品中有机酸的含量。

1.3.4 挥发性风味成分分析

使用固相微萃取（SPME）联合气相色谱/质谱（GC-MS）测定酸豆角中挥发性风味物质。

A.固相微萃取（SPME）样品制备

取酸豆角发酵液2mL，放入5mL的萃取瓶中，拧紧瓶盖。将手动固相微萃取器的萃取头插入到样品瓶盖中，推出纤维头，60℃吸附30min。随后抽回纤维头，拔出萃取头，再将萃取头插入气相色谱仪推出纤维头，在进样口解吸附15min，进行GC-MS检测分析。

B.分析条件

气相色谱条件：色谱柱为VF-5MS30m×0.25mm× 0.25μm弹性毛细管柱；载气He气；载气流量1mL/ min；进样口温度250℃；分流比5：1；升温程序为40℃保持3min，5℃/min线性升温至150℃，10℃/min线性升温至250℃，然后于250℃保持5min。

质谱条件：离子源为EI源，离子阱温度220℃，传输线温度280℃；扫描范围50 amu～1 000 amu；电离电压为70 eV；溶剂延迟4min；谱库NIST 05。

（5）亚硝酸盐检测

根据GB5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐测定》中盐酸萘乙二胺法对亚硝酸盐进行测定[9]。

2 结果与分析

2.1 添加不同比例马奶酒样乳杆菌ZW 3发酵实验

pH和总酸含量是泡菜成熟与否的标志，发酵过程中酸度值的变化是反映发酵过程的数量指标，因此，结合品尝鉴定，测定酸度值可以了解发酵进程并确定产品的形成。在实验条件为：接种量8%（体积分数），盐浓度4%（w/v），糖浓度2%（w/v），室温发酵7 d后，检测发酵蔬菜的酸度。由图1可知，接种发酵组的pH均低于3.305，酸度均大于1.3%；在实验组中，添加马奶酒样乳杆菌ZW3的比例不一样，pH和酸度也不一样。随着马奶酒样乳杆菌ZW 3所占比例的增多，样品的pH随着降低，酸度随着增加。马奶酒样乳杆菌ZW3占发酵剂的比例为1/4的2组实验，pH和酸度差别不明显，并未因为乳酸菌723所占比例的增多而过多的改变；而另外2组随着马奶酒样乳杆菌所占比例的增多，pH和酸度变化明显，当占发酵剂的比例为1/2时，pH可达到3.215，酸度达到1.498%。即马奶酒样乳杆菌ZW 3的添加利于酸豆角酸味的形成。

根据感官评分可以得出，马奶酒样乳杆菌ZW3所占发酵剂的比例为1/3时的感官评分是所有酸豆角中评分最高的；而自然发酵酸豆角的评分不高，可能是由于自然发酵还没有完全成熟，酸度不够。

图1 不同菌种比例对pH及总酸的影响Fig.1 Effectsof strainsproportion on pH valuesand totalacids contentsof pickle

表2 感官评分Table2 Thescoreof sensory evaluation

由于马奶酒样乳杆菌ZW3占发酵剂的比例为1/ 3时的实验组发酵完成后能达到一个良好的效果，产品色香味达到最佳，pH及酸度都可以达到一个非常好的程度，而且风味口感均很好。所以选取马奶酒样乳杆菌ZW3占发酵剂的比例为1/3的实验组作为最佳接种发酵组，与自然发酵进行风味物质的对比分析。

2.2 加入马奶酒样乳杆菌ZW3的酸豆角与自然发酵酸豆角风味物质对比分析试验

泡菜的品质主要是由风味物质决定的，风味物质主要包括有机酸、挥发性的风味物等。这些风味物质也是自然发酵泡菜优于人工接种发酵泡菜的原因[4]。所以实验将人工接种泡菜的风味与自然发酵泡菜的风味进行对比分析，以判断人工接种泡菜的品质，也为指导人工接种泡菜提供科学基础。

实验在前期发酵基础之上，将自然发酵的酸豆角继续发酵，直至发酵成熟，酸度与pH与所选最佳接种发酵组的酸度一致时停止发酵，对2组样品进行有机酸及挥发性风味物质的分析。

2.2.1 有机酸分析

根据标准品的保留时间与含量标准曲线，测得接种发酵酸豆角和自然发酵酸豆角中各有机酸的含量见表3。

泡菜酸味的主要来源是发酵过程中产生的有机酸。有机酸的存在不仅会改善食品的风味，使泡菜具有酸爽的口感，还能改变和加强其他风味物质所产生的味感。发酵后的泡菜主要含有的有机酸有：乳酸，甲酸，草酸，丙酸，琥珀酸，乙酸，苹果酸，柠檬酸，富马酸等。不同的有机酸所带来的风味也不同。乳酸的酸味柔和，有后酸味，可提供柔和的风味；琥珀酸兼有海扇和豆酱类的风味，有研究表明，琥珀酸钠含量为0.114%时就足够呈现出一定程度的鲜味；乙酸有较强的刺激味，有强化食欲的功能；苹果酸具有令人愉快的酸味，其酸味的产生和消失都比柠檬酸缓慢；富马酸具有水果酸味；柠檬酸有令人愉快、清凉的酸味，但味觉消失迅速[10]。

表3 有机酸分析结果Table3 Organic acidscontentsof sample

通过2种发酵方式有机酸种类对比发现，2样品有机酸的种类并无差异，说明人工接种发酵与自然发酵在有机酸的组成上是一致的。从有机酸的含量上看，草酸、甲酸、富马酸含量差别不大，乳酸及琥珀酸的含量接种发酵高于自然发酵；苹果酸、乙酸、柠檬酸及丙酸含量接种发酵低于自然发酵。分析原因可能是因为人工接种发酵在发酵过程中优势菌种固定，而自然发酵中发酵菌种复杂，这种微生物菌群及生物量上的差异性引起了成熟后的泡菜中有机酸含量的差异。乳酸菌发酵产生的乳酸是泡菜酸味的关键成分，加入马奶酒样乳杆菌ZW3的发酵酸豆角乳酸含量明显高于自然发酵，这也有可能是马奶酒样乳杆菌ZW3促进发酵产酸，加速泡菜成熟速度的原因。

2.2.2 挥发性风味物质分析

每一种蔬菜腌制品都有其特征风味物质，且这些特征风味物质挥发性较强[11]。酸菜有其自身的特征香气，酯类、杂环类及其他含氧化合物都对香气有一定贡献[12]。这些香气也可以减少泡菜原料中带有的不良气味。

图2（a）（b）分别为人工接种发酵与自然发酵酸豆角的总离子流色谱图。从接种发酵和自然发酵泡菜的总离子流色谱图可以看出：发酵完成后，达到相同的酸度的情况下，接种发酵泡菜与自然发酵泡菜的挥发性风味物质峰形基本一致，含量上没有太大的变化。

通过GC-MS自带数据分析软件及查询化合物CAS号分析，接种发酵泡菜与自然发酵泡菜共有34种挥发性风味物质检出。主要为酯类、醛类、酮类、醇类及烷烃类、酚类、烯烃类化合物。其中以醇类和酯类组分居多，分别鉴定出14个醇类组分，8个酯类组分。除此之外还有4个烯烃类组分，4个酮类组分以及2个醛类和2个酚类组分。

图2 接种发酵（a）和自然发酵（b）酸豆角的总离子流色谱图Fig.2 The total chroMatograMof inoculation ferMented（a）and natural ferMented（b）cowpe

挥发性风味物质检测结果表明，接种发酵酸豆角中含有几乎全部自然发酵酸豆角中的特征风味物质，且含量相差不大。所以在工业化大规模生产时，可以考虑使用实验组所选用的菌种作为人工接种的发酵剂。

2.2.3 亚硝酸盐的测定

对两组样品进行亚硝酸盐含量的测定，接种发酵的样品亚硝酸盐的含量为0.150mg/kg，自然发酵样品的亚硝酸盐的含量为1.622mg/kg，均符合国家标准GB5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐测定》中规定的泡菜的亚硝酸盐含量不应该超过20mg/kg的标准。并且人工接种样品的亚硝酸盐含量低于自然发酵的样品。

3 结论

综上所述，马奶酒样乳杆菌ZW3可与其他乳酸菌复配用于酸豆角的发酵。在相同接种量的情况下，随着马奶酒样乳杆菌所占比例的增大，发酵过程中产酸速度加快，发酵时间缩短；并且在发酵成熟后，所含有的风味物质在种类与含量上与自然发酵基本一致，可以可作为一种新型蔬菜发酵菌种使用。这一实验结果为发酵蔬菜菌种的开发，加速发酵蔬菜安全及工业化生产奠定了基础。

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App lication of Lactobacillus Kefiranofaciens ZW 3 in Cowpea FerMentation

ZHENGYong-na1，ZHAOYong2，WANG Jing-rui1，WANGYan-ping1，*
（1.Key Laboratoryof Food Nutrition and Safety，Collegeof Food Engineering&Biotechnology，Tianjin University ofScience&Technology，Tianjin 300457，China；2.Community Health Service Centre，Nanshi Street，Heping District，Tianjin 300457，China）

Lactobacillus kefiranofaciens ZW3mixed with Lactobacillus plantaruM299 and Lactic acid bacteria 723 in different proportion for acid fermented cowpea was studied.Under the certain innoculums，fermented cowpea pH was decreased and acidity was increased with the increase of the proportion of Lactobacillus kefiranofaciens ZW3.According to the results of sensory score，fermented cowpea tasted bestwhen the three kindsofbacteriaweremixed with a ratio of1∶1∶1.Through the analysisof the organic acidsand volatile flavor compounds，the types and quantities of organic acids and volatile flavor compounds was consistent between inoculated fermentation of the bestproportion and natural fermentation.Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 was used in fermented vegetablesand the productshavegood acid productivity，rapid lowered pH，and good taste.

Lactobacilluskefiranofaciens ZW 3；sour cowpea；acid production；flavor compounds

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.097

2014-09-24

“十二五”科技部高技术发展研究计划‘863计划’：果蔬发酵食品，调味品及微生物油脂生产关键技术（2011AA100904）

郑永娜（1989—），女（汉），在读硕士，研究方向：食品生物技术。

*通信作者：王艳萍（1962—），女（汉），教授，博士，研究方向：食品生物技术。