银耳多糖抗氧化作用的研究

张泽生，孙东，徐梦莹，田欢，潘季辰

（天津科技大学，食品工程与生物技术学院，天津300457）

银耳多糖抗氧化作用的研究

张泽生，孙东，徐梦莹，田欢，潘季辰

（天津科技大学，食品工程与生物技术学院，天津300457）

研究银耳多糖的抗氧化活性。以银耳为原料，经简单分离纯化，制得银耳多糖。将ICR小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、银耳多糖低、中、高剂量组，通过每日皮下注射D-半乳糖建立亚急性衰老小鼠模型，空白对照组用生理盐水代替。剂量组小鼠灌胃剂量分别为100、200、400mg/（kg·bw），空白对照组和模型对照组用生理盐水代替，每日一次，持续八周。测定比较血清、肝脏、脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）与谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活性、丙二醛（MDA）含量、总抗氧化能力（T-AOC）和皮肤中的羟脯氨酸含量的差异。与模型组相比，银耳多糖剂量组小鼠血清、肝脏、脑组织中的SOD、CAT、GSH-Px活性和总抗氧化能力显著增强，MDA含量的异常上升受到明显抑制，皮肤中的羟脯氨酸含量显著提高，且以银耳多糖中、高剂量组的效果更好。银耳多糖对D-半乳糖致亚急性衰老小鼠具有较强的抗氧化活性。

银耳多糖；D-半乳糖；抗衰老；抗氧化

植物性多糖多提取自我国传统中医药中，因此在诸多方面有着其他生物功能因子不能比拟的优势。其在抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗衰老、抗氧化、抗溃疡、降血糖[1-9]等方面的积极作用使多糖类物质展示了诱人的前景。

目前，已有诸多关于银耳多糖抗肿瘤、降血糖、抗氧化等生物活性的研究报道。进一步的体外抗氧化实验表明，银耳多糖可以有效的清除某些自由基，例如超氧阴离子自由基（O：2-）和羟自由基（·OH-）[10]，但关于银耳多糖体内抗氧化研究的报道却不多，涉及到的体内抗氧化指标也较少，因此本研究通过D-半乳糖建立亚急性衰老模型，检测多个体内抗氧化指标，从多个方面证明银耳多糖的抗氧化作用，为银耳多糖的保健功能提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 银耳多糖溶液的制备

原料购于福建古田县菌益食品有限公司，粉碎后过200目筛，采用热水浸提，等电点法除蛋白，浓缩，乙醇沉淀，冷冻干燥得银耳多糖。用生理盐水复溶银耳多糖干粉，配制成浓度为100、200、400mg/kg的溶液，4℃保存待用。

1.1.2 主要试剂

超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、羟脯氨酸、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 主要仪器

MODULYOD-230冷冻干燥机：Thermo公司；TDL-5-A低速离心机：上海安亭科学仪器厂；Z5高速离心机：SIGMA Germany；QL-901微型漩涡混合器：其林贝尔仪器制造公司；JD1000-2电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；BS224S分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH.SY11-Ni2恒温水浴锅：天津市中环实验电炉有限公司；UV1800紫外可见分光光度计：日本岛津公司。

1.1.4 动物及实验方案选取

SPF级8周龄雄性ICR小白鼠50只，体重（18±2）g，由北京大学医学部实验动物中心提供，适应饲养一周后，按体重成S型随机分为5组，每组10只，即：空白对照组（NC）、D-半乳糖模型对照组（DC）、银耳多糖低（TPL）、中（TPM）、高剂量组（TPH）。造模小鼠均每日定时定点于颈背部皮下注射120mg/（kg·bw）的D-半乳糖灭菌生理盐水溶液，空白对照组用灭菌生理盐水代替，注射量0.1mL/20 g。自造模的第一天起，剂量组小鼠分别灌胃以相应浓度的溶液，空白对照组和模型对照组用生理盐水代替，灌胃量0.2mL/20 g，每日一次，连续8周。小鼠于末次给药后禁食过夜，于处死前称重并记录。小鼠眼球取血、颈椎脱臼处死，快速分离肝脏和脑，准确称取待测组织，按重量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例加生理盐水，冰浴条件机械匀浆，5 000 r/min离心2次，每次10min，吸取上清液，，用生理盐水稀释制成适当稀释倍数匀浆液，于-80℃保存，待测。原血依次在3 500 r/min和5 000 r/min下离心，每次15min，吸取上清液，于-20℃下保存血清待检测。按说明书方法测定SOD、CAT、GSH-Px活力，T-AOC和MDA含量。取小鼠背部皮肤，去毛，除脂，生理盐水洗净，前处理后按说明书方法测羟脯氨酸含量。

1.2 指标测定方法

实验相关生化指标的测定方法均为比色法。

1.3 统计学分析

数据均用SPSS 13.0统计软件进行处理，用单因素方差分析ANOVA（one-way analysisofvariance），以Duncans多重比较检验（Duncansmultiple range tests）。分析实验结果以均值士标准偏差（Mean±SD）表示，采用组间t检验，P＜0.05具有显著性差异，P＜0.01具有极显著性差异。

2 结果

2.1 小鼠体重变化

在连续皮下注射D-半乳糖8周的过程中，正常对照组小鼠毛色光亮，行为如常，灵活好动；模型对照组小鼠则毛色松散缺乏光泽，并且逐渐产生精神萎靡，活动迟缓等一系列衰老体征，此现象充分说明，D-半乳糖衰老模型小鼠造模成功；而其他给予银耳多糖治疗的3组小鼠，其一般情况较模型对照组相比，衰老体征明显改善，以银耳多糖中、高剂量组小鼠的表现尤为明显。

小鼠的体重增长情况是反应生长发育的一个重要指标，每周于固定时间测定一次小鼠的体重，其结果如图1所示。

图1 小鼠的体重变化Fig.1 Bodyweight changesof theMice

所有实验组小鼠的体重变化展现了相同的趋势，与空白对照组相比，模型对照组小鼠体重平均水平均低于正常小鼠，不仅前期增重缓慢，后期体重甚至有明显下降趋势，呈现衰老体征；银耳多糖剂量组与模型对照组小鼠相比，前期体重上升趋势较快，其后期体重下降趋势也有所缓解。其中以银耳多糖中剂量组效果最为明显。

2.2 抗氧化生化指标检测

2.2.1 银耳多糖对小鼠体内SOD活性的影响

图2 银耳多糖对D-半乳糖致衰老模型小鼠（a）血清、（b）肝脏和（c）脑组织中SOD活性的影响（M±SD，n=10）Fig.2 Effectof TP on theactivity of SOD in（a）blood serum，（b）liver and（c）brain in agingMice（M±SD，n=10）

从图2（a）可以看出，与空白对照组相比，模型对照组小鼠血清SOD的活性极显著降低（P＜0.01）；与模型对照组相比，银耳多糖3个剂量组均可显著提高小鼠血清SOD活性，其中银耳多糖中剂量组可极显著提高小鼠血清SOD活性（P＜0.01），银耳多糖低、高剂量组也具有显著性差异（P＜0.05）。

从图2（b）和图2（c）可以看出，与空白对照组相比，模型对照组小鼠肝脏和脑组织SOD活性极显著降低（P＜0.01）；与模型对照组比较，银耳多糖中、高剂量组可显著提高小鼠肝脏和脑组织SOD活性（P＜0.05），且两个剂量组的增进效果与受试物剂量呈量效关系。

2.2.2 银耳多糖对小鼠体内MDA活性的影响

MDA含量增加显示出机体抗氧化能力下降，氧自由基大量产生，脂质过氧化产物增多，因而测试MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。从实验结果可以看出，通过对D-半乳糖衰老小鼠灌以银耳多糖可以降低其体内MDA的含量，降低体内脂质过氧化程度。

图3 银耳多糖对D-半乳糖致衰老模型小鼠（a）血清、（b）肝脏和（c）脑组织中MDA含量的影响（M±SD，n=10）Fig.3 Effectof TP on the contentsofMDA in（a）blood serum，（b）liver and（c）brain in agingMice（M±SD，n=10）

从图3可知，与空白对照组相比，模型对照组小鼠血清、肝脏和脑组织中的MDA极显著增加（P＜0.01）；与模型对照组相比，小鼠血清、肝脏和脑组织中，银耳多糖各剂量组MDA的含量逐渐降低，且改善效果与受试物剂量呈量效关系，其中，剂量组血清及肝脏中MDA含量均极显著降低（P＜0.01）；中、高剂量脑组织中MDA含量显著降低（P＜0.05）。

2.2.3 银耳多糖对小鼠体内CAT活性的影响

图4 银耳多糖对D-半乳糖致衰老模型小鼠（a）血清（b）肝脏和（c）脑组织中CAT活性的影响（M±SD，n=10）Fig.4 Effectof TP on theactivity of CAT in（a）blood serum（b）liver and（c）brain in agingMice（M±SD，n=10）

各组小鼠血清中CAT活性如图4（a）所示，模型对照组与空白对照组相比，其血清CAT活性明显降低，具有显著性差异（P＜0.05）；与模型对照组相比，银耳多糖中、高剂量组可显著提高小鼠血清中CAT活性（P＜0.05）。

各组小鼠肝脏和脑组织中CAT活性如图4（b）和4（c）所示。从图可以看出，模型对照组与空白对照组相比，其肝、脑组织中CAT活性极显著降低（P＜0.01）。与模型对照组相比，银耳多糖中、高剂量组均可提高小鼠肝脏和脑组织中CAT活性，且具有显著性差异（P＜0.05），其中银耳多糖高剂量组中肝组织CAT活性极显著性回升（P＜0.01），并表现出剂量依赖趋势。

2.2.4 银耳多糖对小鼠体内T-AOC活性的影响

各组小鼠体内T-AOC活性如图5所示。

图5 银耳多糖对D-半乳糖致衰老模型小鼠（a）血清（b）肝脏和（c）脑组织中T-AOC活性的影响（M±SD，n=10）Fig.5 Effectof DCIon theactivity of T-AOC in（a）blood serum（b）liver and（c）brain in agingMice（M±SD，n=10）

对小鼠的血清进行T-AOC活力的测试，结果如图5（a）所示，模型对照组与空白对照组相比，其血清中T-AOC活性显著降低（P＜0.05）；与模型对照组小鼠相比，不同剂量的银耳多糖可在不同程度上提高小鼠血清中T-AOC的活性，银耳多糖高剂量组小鼠血清中T-AOC活性显著性提高（P＜0.05），并表现出剂量依赖性。

从图5（b）和5（c）可以看出，模型对照组小鼠肝、脑组织中T-AOC活性与空白对照组相比，其T-AOC活性显著降低（P＜0.05）；剂量组小鼠相比模型小鼠，TAOC有不同程度的增长，其增强效果与受试物剂量呈现量效关系，其中银耳多糖中、高剂量组可显著提高小鼠肝、脑组织中T-AOC活性（P＜0.05）。

2.2.5 银耳多糖对小鼠体内GSH-Px活性的影响

各组小鼠体内GSH-Px活性如图6所示。

图6 银耳多糖对D-半乳糖致衰老模型小鼠（a）血清（b）肝脏和（c）脑组织中GSH-Px活性的影响（M±SD，n=10）Fig.6 Effectof TP on theactivity of T-AOC in（a）blood serum（b）liver and（c）brain in agingMice（M±SD，n=10）

从图6可以看出，银耳多糖对小鼠血清、肝、脑组织中GSH-Px活力的影响均表现出相似的趋势。模型对照组小鼠体内GSH-Px活性与空白对照组相比极显著降低（P＜0.01）；银耳多糖各剂量组与模型对照组相比，均可提高小鼠血清、肝、脑组织中GSH-Px活性，且三个剂量组的增进效果与受试物剂量呈现量效关系，其中银耳多糖中、高剂量组可显著提高小鼠血清、肝、脑组织中GSH-Px活性（P＜0.05），并且在较高剂量干预时，小鼠脑组织中该酶的活力几乎接近正常水平。

2.2.6 银耳多糖对皮肤中羟脯氨酸含量的影响

羟脯氨酸是生命体中构成胶原蛋白的重要前体。羟脯氨酸的含量也标志着机体氧化的程度，故测定皮肤中羟脯氨酸的含量以鉴定小鼠氧化衰老的程度，同时也是鉴别银耳多糖对于皮肤保养效果的指标。

图7 银耳多糖对D-半乳糖致衰老模型小鼠皮肤中羟脯氨酸含量的影响（M±SD，n=10）Fig.7 Effectof TP on theactivity of IF in skin agingMice（M±SD，n=10）

从图7可知，与空白对照组相比，模型对照组小鼠皮肤中的羟脯氨酸极显著降低（P＜0.01）；与模型对照组相比，银耳多糖各剂量组小鼠皮肤中羟脯氨酸的含量逐渐增长，且增长效果与受试物剂量呈量效关系，剂量组羟脯氨酸含量均极显著增高（P＜0.01），表明银耳多糖可以有效改善D-半乳糖致衰老小鼠皮肤中羟脯氨酸含量的下降，缓解小鼠氧化衰老的程度。

3 讨论

衰老是人类永远不能回避的话题，目前具有本源性解释的衰老机制是自由基学说，其本质内容为自由基在生物体内不断地通过非酶反应与酶反应产生活性氧自由基，但在抗氧化酶及外源性和内源性抗氧化剂的协同作用下，活性氧自由基不断地被清除。在正常生理情况下，活性氧自由基可维持于有利无害的极低水平，并保持稳衡性动态。平衡浓度的活性氧自由基中一部分可履行生理作用，而另一部分可损伤生物分子。生物体的细胞不时受到活性氧自由基的攻击而发生损伤，在衰老、应激及某些病理情况下自由基产生增多或清除能力减弱，使得自由基对肌体造成严重损伤[1]，从而造成人体的衰老。现代生活中的许多生活因素例如紫外线、X射线、γ射线、香烟烟雾、氧化性污染物、电子辐射等都会诱发正常代谢以外的异常自由基的产生从而造成机体内的DNA、蛋白质和脂类的损伤[2-4]，损伤的积累导致细胞衰老或死亡。因此，在日常饮食中，有意的摄入具有抗氧化功效的食品、饮品变得极为重要。

大量实验结果已经证明，多糖类物质具有抗氧化作用，我国传统中医药宝库为多糖的提取和研究提过了广阔的研究基础和便利条件。从天然植物中提取多糖类物质，经人体摄取或代谢，通过对自由基的清除或对衰老基因的表达下调，从而达到人体抗衰老功效的方法，成为了研究抗衰老的主流。这类多糖无毒副作用，提取成本低廉、工艺简单；食用和使用的安全，具有可靠的安全性、广阔的市场和远大的前景。

本实验结果表明，正常ICR小鼠经连续8周皮下注射D-半乳糖后，体重明显下降，其血清、肝脏、脑组织中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和总抗氧化能力均有不同程度的抑制或下降，丙二醛含量极显著性上升，小鼠皮肤中羟脯氨酸的含量极显著性降低，而银耳多糖经体内代谢可效提高小鼠体内SOD、CAT、GSH-Px活性，降低MDA含量，提高T-AOC（总抗氧化能力），增加羟脯氨酸含量，甚至有个别体内抗氧化指标几乎恢复至正常水平，并且银耳多糖在较高剂量时作用显著，且成一定的剂量依赖趋势，由此得到初步结论：银耳多糖对D-半乳糖致亚急性衰老小鼠具有较强的抗氧化活性。银耳多糖可以降低机体氧化应激水平，防止脂质过氧化反应，达到抗氧化抗衰老的作用[11-12]。因此，综合上述实验结果，可以认为银耳多糖可以显著增强机体内抗氧化相关酶类的活性，抑制自由基的产生，抑制脂质过氧化过程中产生的不良代谢产物。

经过大量的实验证明，多糖类物质的抗氧化效果以未纯化的粗品为好，其抗氧化效果远好于纯化后的某类组分，银耳多糖的抗氧化实验结果也证实了这个结论。这可能是由于银耳多糖等绝大多数多糖类物质的抗氧化活性是靠多种多糖组分共同来表现并完成的，故有此特点。

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Study on the Antioxidation Effect of Tremella Polysaccharide

ZHANGZe-sheng，SUNDong，XUMeng-ying，TIANHuan，PAN Ji-chen
（Collegeof Food Engineeringand Biological Technology，Tianjin University ofScienceand Technology，Tianjin 300457，China）

Toexplore theantioxidantactivity ofpolysaccharides froMtremella in vivo.The polysaccharideswere obtained froMtremella after being separated and purificated.ICR mice were randomly assigned into Normal Group，Control Group，Low，Middle and High dose Group of polysaccharides froMtremella.Agingmodelmice wereestablished by subcutaneous injection ofD-galactose.Normalmicewere treated in the samemannerexpect thatsterile saline instead ofD-galactose.Modelmicewere treated by differentdosagesof polysaccharides（100，200，400mg/（kg·bw））forsuccessive8weeks，blank and controlmiceweregiven thedifferentvolumesofsaline according to the weight of the mice.The contents ofmalonialdehyde（MDA），the activities of superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），glutathioneperoxidase（GSH-Px）and totalantioxidantcapacity（T-AOC）in serum，brain and liver tissues were observed and hydroxyproline contents in skin were also determinated. Polysaccharides froMtremella could significantly enhance the activitiesof SOD，CAT，GSH-Px and T-AOC in serum，brain and liver tissues，reduce MDA contents and raise hydroxyproline contentsmarkedly in a dosedependentmanner.The higher dosages of polysaccharides performed better.polysaccharides froMtremella possessed astrongantioxidantactivity in D-galactose induced agingmice.

tremella polysaccharide；D-galactose；anti-aging；antioxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.004

2014-09-15

张泽生（1956—），男（汉），教授，博士，研究方向：食品添加剂与功能配料。