LAMP®技术在肺炎支原体快速检测中的应用

辛德莉 李丹 米佳

1 首都医科大学附属友谊医院北京热带病研究所 （北京 100050）

2 北京蓝谱生物科技有限公司 （北京 100081）

与传统的核酸扩增检测的方法聚合酶链式反应（PCR）相比，LAMP®方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强，反应结果判定简单，检测成本低等特点。LAMP®方法的检测灵敏度高于普通PCR 2～3 个数量级，而且，LAMP®的扩增是一个等温过程（60～65˚C），扩增时间短（1h），对设备的要求简单，只需要一个水浴锅或恒温装置即可完成。LAMP®反应结果的检测也很简单，不需要像普通PCR 那样进行凝胶电泳，只需要通过肉眼直接观察白色浑浊或者绿色荧光即可，是一种简便、快捷、适合进行临床及大量样品的高通量检测方法。

LAMP®技术已在医疗、动植物、水产、食品、环境领域的病毒、细菌、寄生虫等方面得到广泛应用，如Yiyue et., al 利用LAMP®技术快速检测H7N9 病毒，灵敏度可达10 拷贝，具有非常好的特异性[2]。Jianyu et., al 利用环介导等温扩增法，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA 基因为靶基因，特异的检测出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的，灵敏度能达到10 拷贝DNA 或10CFU/反应[3]。Jaymin C et., al 采用环介导等温扩增法特异的检测疟原虫，灵敏度和特异性均与金标准槽式PCR 一致[4]。但是在支原体上的研究较少，李鹏等建立了猪肺炎支原体的环介导等温扩增诊断方法，其灵敏度可达6 拷贝，且具有很好的特异性[5]。谢秀兰等建立的羊丝状支原体簇的快速环介导等温扩增检测方法，检出限为10pg/µl[6]。

肺炎支原体是一种介于病毒和细菌之间，能独立生活的最小微生物，缺乏细胞壁，呈现出高度多型性，是人类支原体肺炎的病原体。肺炎支原体（Mycoplasma pneumonia, MP）是引起支原体肺炎的主要病原体，支原体肺炎约占各种肺炎的10%，已成为发病率最高的传染疾病，严重者可导致死亡，潜伏期一般为2～3 周，常见于儿童和青少年，秋冬发病较多。

图1. 使用钙黄绿素检测LAMP®反应原理图

支原体肺炎的临床表现主要为持续发热、咳嗽、咳痰等，临床表现和胸部X 线检查并不具特征性，单凭临床表现和胸部X 线检查无法做出诊断，若要明确诊断，需要进行肺炎支原体的检测。目前，国内肺炎支原体的诊断主要依靠病原体培养、血清学检测和PCR 法。

肺炎支原体培养较困难，存在临床标本中病原体含量较少、呼吸道污染的杂菌较多、耗时及阳性率低等缺点，目前的临床检测中已很少应用。血清学检查主要有补体结合试验，冷凝集试验，凝集试验和酶联免疫吸附法（ELISA）。血清学技术主要依靠抗体进行检测，有明显的滞后性，且受个体免疫差异影响较大，检测灵敏度和特异性较低。随着分子生物学的发展，PCR 技术已在临床诊断中得到较好应用，但也存在灵敏度较低，耗时较长，操作较复杂，对技术人员的要求较高，对设备的要求较高，无法实现基层化及现场化等缺点。

近年来，支原体肺炎占了小儿肺炎的20%以上，随着诊断技术的发展，其检出率增高，发现它也是小儿呼吸道感染的重要病原体，日益得到重视。研究出一种快速、准确、简便的检测方法将有助于及时发现、及时治疗。

图3. MP-LAMP® 法特异性实验结果

图4. MP-LAMP® 法灵敏度实验结果

本研究将环介导等温扩增技术应用于肺炎支原体的检测中，首先从NCBI 上查找肺炎支原体特异基因序列，使用LAMP®专用引物设计（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）设计多组引物。为了能特异的对引物进行筛选，以及对引物工作浓度、反应时间进行控制，本实验采用日本荣研LAMP®技术的专用产品——Loopamp®DNA 扩增试剂盒（图2-A）和Loopamp®实时浊度基因快速扩增检测系统（图2-B）筛选出最佳引物，将最佳引物进行特异性、灵敏度实验。

将收集的临床样本肺炎支原体及解脲支原体、人型支原体、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎可雷白杆菌样本进行特异性实验，采用MP-LAMP®方法进行检测，只有肺炎支原体显示为阳性，其他菌均显示为阴性（图3），表明MP-LAMP®方法具有较好的特异性。

将定量的MP 质粒进行10 倍梯度稀释后（6000copy，600copy，60copy，6copy，0.6copy）作为模板进行灵敏度实验，实验结果表明，MPLAMP®方法的灵敏度可达6 拷贝（图4）。

传统进行肺炎支原体检测的方法费时，准确度、灵敏度较低，容易漏检或误检，而MPLAMP®方法在一个小时内即可得到结果，且灵敏度和特异性高，为临床上快速、准确诊断肺炎支原体提供可能。

[1] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28( 12) : e63.

[2] Yiyue Ge, Bin Wu, Xian Qi.et al., Rapid and Sensitive Detection of Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus by Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Combined with a Lateral-Flow Device，Pols one，8（8）：e69941

[3] Jianyu Su, Xiaochen Liu, Hemiao Cui, et al., Rapid and simple detection of methicillin resistance staphylococcus aureus by orfX loop-mediated isothermal amplification assay. BMC Biotechnology 2014, 14:8

[4] Jaymin C. Patel, Jenna Oberstaller, Maniphet Xayavong, et al., Real-Time Loop-Mediated Isothermal Amplification (RealAmp) for the Species-Specific Identification of Plasmodium vivax，Pols one，8（1）e54986）

[5] 李鹏，马艳娇，于剑等，猪肺炎支原体环介导等温扩增检测方法的建立. 中国生物制品学杂志，2011，4：21-24.

[6] 谢秀兰，康晓冬，储岳峰等，羊丝状支原体簇环介导等温扩增检测方法的建立. 中国畜牧兽医，2012,39（12）