SH2⁃Bβ抗体治疗肥胖哮喘模型小鼠肥胖和哮喘的机制研究

金韵，李新鸣，齐金萍，贾志红

（沈阳医学院1.解剖学教研室；2.微生物学教研室；3.2012级临床医学，沈阳110034）

SH2⁃Bβ抗体治疗肥胖哮喘模型小鼠肥胖和哮喘的机制研究

金韵1，李新鸣2，齐金萍1，贾志红3

（沈阳医学院1.解剖学教研室；2.微生物学教研室；3.2012级临床医学，沈阳110034）

目的探讨SH2-Bβ抗体对肥胖哮喘模型小鼠的治疗作用。方法采用8周C57BL/6小鼠（36只），随机分为正常组（标准饲料喂养）、肥胖哮喘组（高脂饲料喂养）和SH2-Bβ抗体干预组。测量各组小鼠体质量；应用免疫组织化学方法检测SH2-Bβ在各组小鼠肺内及下丘脑的表达；应用小鼠肺功能仪检测各组小鼠气道阻力变化。结果肥胖哮喘组体质量明显高于正常组和SH2-Bβ抗体干预组（P＜0.05）；免疫组织化学染色显示，在下丘脑，SH2-Bβ在肥胖哮喘组小鼠表达降低，明显低于SH2-Bβ抗体干预组和正常组（P＜0.05）。在肺内，SH2-Bβ在肥胖哮喘组小鼠表达增高，明显高于SH2-Bβ抗体干预组和正常组（P＜0.05）；肥胖哮喘组小鼠的气道阻力明显高于SH2-Bβ抗体干预组和正常组（P＜0.05）。结论SH2-Bβ抗体可使肥胖哮喘模型小鼠下丘脑内SH2-Bβ表达上调，同时使肺内SH2-Bβ表达下调，降低体质量，降低肺内活化炎性细胞数量，进而降低气道阻力，使肥胖哮喘得到缓解。

SH2-Bβ；肥胖；哮喘；小鼠

长期以来，研究人员一直认为超重与哮喘之间存在某种联系。但这种关系的机制还不清楚。最近的研究表明肥胖与儿童哮喘的症状相关，控制体质量将有利于哮喘儿童［1］。SH2-Bβ是下丘脑内重要的能量代谢和糖代谢的正向调节者［2］。高脂饮食可使下丘脑内SH2-Bβ表达下调，从而导致肥胖；肺内气道上皮和炎性细胞SH2-Bβ过表达使气道阻力增加［3］。因此，下丘脑和肺的SH2-Bβ可能是肥胖哮喘发病的重要基础。调节下丘脑和肺的SH2-Bβ表达将成为肥胖哮喘患者新的有效治疗方法。我们以前的研究发现SH2-Bβ抗体可减轻哮喘小鼠气道炎症和气道高反应性［4］，既然SH2-Bβ与体质量的调控相关，SH2-Bβ抗体是否会缓解肥胖哮喘呢？本研究经鼻应用SH2-Bβ抗体，观察肥胖哮喘模型小鼠体质量以及SH2-Bβ在肺内及下丘脑表达变化，同时检测气道阻力，探讨SH2-Bβ在肥胖哮喘中的作用机制以及SH2-Bβ抗体的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

SH2-Bβ羊多克隆IgG抗体（Santa Cruz，sc-10827），SABC试剂盒、DAB（中国武汉博士德生物公司）。电子天平（BS110S，德国Startorius公司），内切式电动组织匀浆器（瑞士Kinematica公司），超声雾化器（JWC-201D型，北京超声仪器厂），紫外分光光度计（DU70型，美国Beckman公司），电泳转印仪（美国Bio-Rad公司）。其余为国产分析纯。

1.2 实验动物及饲料配制

选用健康、雌性、出生8周的c57BL/6小鼠，体质量21 g左右。普通饲料：玉米粉30%，豆饼21.0%，麸皮10.0%，次粉28.0%，鱼粉9.0%，酵母粉1.0%，鱼肝油1%（g/100 g）等。高脂饲料：猪油12.0%，奶粉8.0%，鸡蛋10.0%，花生5.0%，麻油3.0%，以普通饲料补足100 g混成含12%猪油的高脂饲料，食用前2 d配好，低温保存。

1.3 动物分组

将36只c57BL/6小鼠适应性喂养1周后，按体质量随机均分为3组：对照组（12只）、肥胖哮喘组（12只）、SH2-Bβ抗体干预组（12只），对照组喂普通饲料，肥胖哮喘组和SH2-Bβ抗体干预组喂高脂饲料。自由饮食水，共饲养8周。每周称体质量1次，以体质量超过对照组体质量2 g作为肥胖标准。

1.4 肥胖哮喘小鼠模型制备及抗体干预处理

4周高脂饲料喂养后，（1）肥胖哮喘组：第1天每只小鼠腹腔注射20 μg卵蛋白和2 mg氢氧化铝（混合于0.5 mL PBS中）。第8天和第14天每只小鼠腹腔注射10 μg卵蛋白和1 mg氢氧化铝（混合于0.5 mL PBS中）。26～30 d将小鼠置于封闭容器中，给予5%卵蛋白（PBS配成）雾化吸入激发哮喘发作（1次/d），每次25 min；（2）SH2-Bβ抗体干预组：操作同肥胖哮喘组，每次雾化吸入5%卵蛋白溶液前3 h经鼻腔滴入SH2-Bβ抗体（1∶50稀释液25 μL）。各组随机选出6只小鼠于最后1次激发后测气道阻力，其余最后1次激发后24 h处死。（3）对照组：以PBS代替卵蛋白注射和雾化吸入，鼻腔滴入与抗体等量生理盐水。

1.5 气道阻力的测定

实验结束后，自由饮水，禁食12 h后各组随机取6只小鼠，以1%戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）腹腔麻醉，16 G气管插管，用AniRes 2003动物肺功能分析系统（贝兰博科技有限公司）测定气道阻力。呼吸频率为1.67 breaths·S-1，潮气量为0.2 mL，正压气压为0.02～0.04 kPa。经颈静脉浓度梯度增加应用甲乙酰胆碱（methacholine，MCh）（0～0.2 μg·g-1）激发气道阻力。待曲线平稳后进行下次给药。

1.6 免疫组织化学反应（SABC法）检测SH2-Bβ表达

各组取6只小鼠用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉（40 mg·kg-1），用0.1 mol·L-1PBS配制的含有多聚甲醛（40 g·L-1）灌流液灌流固定后取下丘脑和肺，后固定24 h后移入0.87 mol·L-1的蔗糖缓冲液中至标本沉降。OCT包埋，恒冷箱连续切片（厚14 μm），冷风干燥后进行免疫组织化学染色（SABC法）。一抗SH2-Bβ工作浓度为1∶150，DAB显色。经SH2-Bβ免疫组织化学染色切片，每块组织随机取3～4张切片，且各组所选部位相同，每张切片平均选取4个视野，使用Metamoph图像分析系统，进行光密度测定。测量值与相应阴性对照切片测量值相减后的平均值为各区域最终平均光密度值。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠实验结束时体质量比较

肥胖哮喘组实验结束时平均体质量和体质量变化均值明显高于SH2-Bβ抗体干预组和正常组（P＜0.05），见表1。

表1 各组小鼠实验结束时体质量比较结果Tab.1 Comparison of the weight among three groups

表1 各组小鼠实验结束时体质量比较结果Tab.1 Comparison of the weight among three groups

1）P＜0.01 vs groups NS and OB+AS.NS，normal control；OB+AS，obese+asthma.

2.2 各组小鼠SH2-Bβ在下丘脑的表达

对照组小鼠下丘脑多数细胞呈SH2-Bβ阳性（图1A），肥胖哮喘组SH2-Bβ阳性细胞数明显减少（图1B）。肥胖哮喘组小鼠下丘脑内SH2-Bβ免疫阳性产物平均光密度值为0.212±0.019，明显低于对照组（0.685±0.011）和SH2-Bβ抗体干预组（0.512±0.021，P＜0.05；图1C）。

图1 免疫组织化学染色各组小鼠下丘脑SH2⁃Bβ表达的比较SABC法×400Fig.1 Comparison of SH2⁃Bβ expression in hypothalamus of different groups by immunohistochemistry staining SABC×400

2.3 SH2-Bβ在肺组织的表达

对照组小鼠肺组织支气管上皮有少数细胞呈SH2-Bβ阳性，炎性细胞数量少，含少量SH2-Bβ阳性物质（图2A）。肥胖哮喘小鼠肺组织细支气管、肺泡上皮细胞和较多炎性细胞呈SH2-Bβ强阳性（图2B）。抗体干预组与肥胖哮喘组比较肺组织细支气管、肺泡上皮细胞SH2-Bβ阳性物质减少，炎性细胞数减少且SH2-Bβ免疫阳性产物减少（图2C）。肥胖哮喘小鼠肺内SH2-Bβ免疫阳性产物平均光密度值为0.742±0.015，明显高于对照组（0.207±0.019）和抗体干预组（0.312±0.022）（P＜0.05）。

图2 免疫组织化学染色各组小鼠肺SH2⁃Bβ表达的比较SABC法×400Fig.2 Comparison of SH2⁃Bβ expression in lung of different groups by immunohistochemistry staining SABC×400

2.4 各组小鼠气道阻力变化

肥胖哮喘组气道阻力较正常组和抗体干预组明显升高（P＜0.05）。见图3。

图3 anti⁃SH2⁃Bβ对甲乙酰胆碱激发的气道阻力的影响Fig.3 Effect of anti⁃SH2⁃Bβon airway resistance in response to methacholine challenges

3 讨论

SH2-Bβ是细胞内一种连接物蛋白。Ren等［5］通过对小鼠的实验表明，SH2-Bβ是瘦素敏感性、能量平衡和体质量的重要调节者。Duan等［6］的研究也表明SH2-Bβ是瘦素及其他多种细胞因子发挥作用的重要调节者。扰乱SH2-Bβ基因可能导致严重瘦素抵抗、食欲过盛、肥胖和肥胖相关的代谢综合征。

本实验结果表明：肥胖哮喘小鼠下丘脑内SH2-Bβ的表达下降，而肺内SH2-Bβ过表达，经鼻应用SH2-Bβ抗体，下丘脑内SH2-Bβ的表达上调，肺内SH2-Bβ的表达下调，使肥胖哮喘小鼠体质量减轻，同时肺内炎性细胞数量减少，气道阻力降低。

研究表明，通过调节饮食、运动和药物治疗降低体质量，可以改善支气管哮喘儿童的系统性炎症［7］。而Jensen等［8］的研究则认为，降低体质量只能改变肺功能，减轻哮喘症状，不改变支气管哮喘患者的炎症和气道高反应性。本研究经鼻腔应用SH2-Bβ抗体，一方面使肥胖哮喘模型小鼠体质量降低，另一方面减少了肺内炎性细胞数量，进而减少炎性介质的释放，相当于从抗炎和降低体质量双方面使肥胖哮喘得到缓解，既有机械通气的改善，又有肺内炎症和气道反应性的改善。目前对肥胖哮喘的研究常会得出不同结论，主要由于干预措施的不同，比如单纯降低体质量，降低体质量同时抗炎，抗氧化应激［7，9，10］。叶泽慧等［10］认为肥胖能增加甲乙酰胆碱的敏感性，并限制吸入性糖皮质激素对哮喘的治疗。本研究也发现肥胖哮喘小鼠在甲乙酰胆碱刺激下的气道阻力明显增加。Ren等［2］的研究表明，敲除脑内SH2-Bβ基因，小鼠出现食量剧增，并导致肥胖。本研究经鼻腔应用SH2-Bβ抗体，引起了下丘脑内SH2-Bβ表达上调，并降低体质量，这说明SH2-Bβ抗体可能经嗅细胞直接吸收入脑或经其他途径到脑内发挥作用。鼻腔给药的应用被认为存在巨大的潜在应用价值，它使得通过口服或静脉给药不能通过血脑屏障的药物得以进入脑内发挥作用［11，12］。洪佳璇等［13］关于肥胖儿童与哮喘病的相关性研究表明，哮喘肥胖儿嗜酸性细胞数明显增高；其肺功能明显降低。而且肥胖能增加嗜酸细胞活性［14］，肥胖者血中嗜酸细胞细胞数量和活性变化造成肺功能损伤［15］。本实验发现，肥胖哮喘小鼠肺内高表达SH2-Bβ的细胞，大多为嗜酸性粒细胞，经鼻腔应用SH2-Bβ抗体，使肺内炎性细胞减少及SH2-B β的表达下调，同时气道阻力下降，说明肺内炎性细胞减少及SH2-Bβ的表达下调使得哮喘状态下过强的嗜酸性粒细胞免疫反应受到抑制。

综上所述，经鼻应用SH2-Bβ抗体，通过改变下丘脑神经元的SH2-Bβ表达，使体质量减轻，免疫受到抑制。这一生长和免疫抑制作用可能通过神经—内分泌—免疫网络得以实现，也不排除SH2-Bβ抗体对中枢和周围组织的不同作用。具体的作用机制有待进一步研究。

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（编辑 武玉欣）

Mechanism Study ofSH2-BβAntibody for Treating Obese and Asthma in Mice Model

JINYun1，LIXin-ming2，QIJin-ping1，JIA Zhi-hong3
（1.DepartmentofAnatomy，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China；2.DepartmentofMicrobiology，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China；3.2012 Clinic Medicine，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China）

ObjectiveTo explore the therapy effectsofSH2-Bβantibody in the obese asthma mice.MethodsTotally 36 C57BL/6 mice（female）aged 8 weeks were used throughout the study.Mice were randomized to 3 groups，including a standard rodent chow（NS，n=12），a high fat diet chow obese asthma group（OB+AS，n=12）and the anti-SH2-Bβ intervene group.The weight was measured，and the SH2-Bβ expression in hypothalamus and lung was determined by immunohistorical staining.The changes of the airway resistance were evaluated by AniRes 2003 animal lungs function analysis system.ResultsThe weightofOB+AS group was higherthan thatofNCgroup and anti-SH2-Bβintervene group（P＜0.05）.Immunohistochemistry staining demonstrated that SH2-Bβ expression in hypothalamus of OB+AS group were decreased compared with those of NC group and anti-SH2-Bβ intervene group（P＜0.05）.SH2-Bβ expression in lung of OB+AS group were increased compared with those of NC group and anti-SH2-Bβ intervene group（P＜0.05）.Airway resistance to methacholine（MCh）was significantly increased in OB+AS group compared with anti-SH2-Bβintervene group（P＜0.05）.ConclusionSH2-Bβantibody upregulated the SH2-Bβexpression in hypothalamus，butdownregulate its expression in lung.The obese asthma may be remitted through the decreased weight，number of the activated inflammatory cells and also airway resistance.

SH2-Bβ；obesity；asthma；mice

R392.5；R562.2+5

A

0258-4646（2014）06-0508-04

金韵（1963-），女，副教授，本科.

齐金萍，E-mail：qijinping2013@163.com

2014-02-19

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