早期补救性卵胞浆内单精子显微注射在可疑受精障碍患者中的应用

王 琰，王志强，柴三明，倪亚莉，安锦霞，冯 帆

（甘肃省妇幼保健院，甘肃 兰州 730050）

早期补救性卵胞浆内单精子显微注射在可疑受精障碍患者中的应用

王 琰，王志强，柴三明，倪亚莉，安锦霞，冯 帆

（甘肃省妇幼保健院，甘肃 兰州 730050）

目的 对体外受精—胚胎移植（IVF-ET）治疗周期中可疑受精障碍患者采用早期补救性卵胞浆内单精子显微注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI）和部分卵母细胞单精子卵泡浆内显微注射（Half-ICSI）进行授精，比较两种不同授精方式的临床应用效果。方法 回顾性分析2013年1—12月在我院进行IVF-ET治疗的患者，对可疑受精障碍者采用早期补救性ICSI和Half-ICSI授精，比较两种授精方式受精率、正常受精率、卵裂率、可利用胚胎率、优质胚胎率、胚胎种植率及临床妊娠率，探讨两种授精方式在可疑受精障碍患者中的临床应用价值。结果 早期补救性ICSI组受精率、正常受精率、可利用胚胎率以及优质胚胎率明显较Half-ICSI组高，差异有显著性（P＜0.05）；而两组在卵裂率、正常卵裂率、胚胎种植率以及临床妊娠率之间差异无显著性（P＞0.05）。早期补救性ICSI组临床妊娠率较Half-ICSI组高4.11%。结论 IVF-ET常规授精失败后行早期补救性ICSI可明显提高受精率，是可疑受精障碍患者的最佳授精方式。

早期补救性卵胞浆内单精子显微注射；可疑受精障碍；体外受精-胚胎移植；妊娠率

据报道，在体外受精—胚胎移植（IVF-ET）周期中，由于不孕患者本身以及临床刺激方案等原因，低受精或不受精的发生率为10%～20%[1]。有研究表明，在IVF-ET常规授精18～20 h后实施补救性卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）可明显提高受精率，但却很难获得高质量的可利用胚胎而不能使临床结局获得有效改善[2]。随着对卵子微观结构的深入研究，人们发现卵子在加精后2～4 h内即可完成受精，受精后6 h，大部分受精卵会排出第二极体，从而方便观察卵子的受精情况，有利于对卵子是否受精做出较明确的判断而及早实施补救性ICSI[3，4]。虽然补救时ICSI可以有效解决卵母细胞不能正常受精的问题，但却存在一些潜在的治疗风险[5，6]，因此，应该严格把握ICSI的适应证，为可疑受精障碍患者实施效果最佳、风险最小的体外授精方式。目前，对可疑受精障碍患者常用的授精方式有早期补救性ICSI和部分卵母细胞单精子卵胞浆内显微注射（Half-ICSI）两种，本研究通过回顾性分析本中心接受两种不同授精方式患者的相关资料，旨在寻找针对可疑受精障碍患者的最佳授精方式。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2013年1—12月在我院接受IVF-ET治疗的，因可疑受精障碍而实施早期补救性ICSI或Half-ICSI并在同周期进行移植的患者101例，其中早期补救性ICSI组66例，Half-ICSI组35例。两组患者均为原发性不孕，年龄＜35岁；女方至少一侧输卵管通畅；男方弱精症但精液质量未达ICSI指征。

1.2 研究方法

1.2.1 控制性超排卵方案 所有患者均采用我院常规小针长方案促排卵[7]，即在前次月经黄体中期开始皮下注射促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a，0.1 mg/支，Ipsen），达降调标准后给予重组卵泡刺激素（Gona-F，445 IU/支，Serono）或国产卵泡刺激素（丽申宝，75 IU/支，珠海丽珠药业）150～300 IU/d直到HCG日。当出现至少3个直径大于18 mm的卵泡后于当晚21时肌注HCG 5 000～10 000 IU，36 h后取卵。

1.2.2 精液处理 取卵当日上午，男方采用手淫法将精液留取于一次性无菌精杯中，静置于热台待液化后采用密度梯度离心法优选精子，处理完毕后将优选的精子沉淀轻轻加入已装有平衡培养液的试管下层并置于CO2培养箱中使其再次上游，授精时取培养液上层精子。

1.2.3 授精方法及受精评估 早期补救性ICSI组：于注射HCG后38～40 h内微滴授精，精子密度为2.8～3.0万条精子/卵，加精后4 h观察受精情况，若双极体（2Pb）卵母细胞所占比例不足成熟卵子的50%，则继续培养至6 h，仍不足50%则对0Pb和1Pb卵母细胞实施补救性ICSI。Half-ICSI组：将一半的卵母细胞以80 U/ml透明质酸酶（Sage）拆除颗粒细胞后直接实施ICSI，剩余卵子常规IVF-ET授精。

16～18 h后评估卵母细胞受精情况，观察到双原核（2PN）为正常受精。

40 h、64 h后观察胚胎分裂情况，根据卵裂球数目、大小是否均匀以及碎片数目评定胚胎等级，3d龄胚胎卵裂球数目≥7、碎片≤20%为优质胚胎；卵裂球数目≥5，碎片≤30%为可利用胚胎。根据患者自身情况每周期选择2～3个胚胎进行移植。

1.2.4 临床妊娠判定 胚胎移植后14 d血HCG阳性者为生化妊娠，5周后B超观察到妊娠囊和胚胎原始心管搏动者为临床妊娠。

1.3 统计学处理

所有数据采用Excel建立数据库，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，定量资料采用t检验进行比较，率的比较采用χ2检验。P＜0.05，差异有显著性。

2 结果

2.1 一般情况比较

早期补救性ICSI组和Half-ICSI组在年龄、不孕年限、病因、Gn总量、获卵数、MⅡ卵数、基础FSH以及移植日子宫内膜厚度间差异均无显著性（P＞0.05），具有可比性（见表1）。

表1 早期补救性ICSI组和Half-ICSI组一般情况比较（±s）

表1 早期补救性ICSI组和Half-ICSI组一般情况比较（±s）

组别 年龄（岁）不孕年限（年）Gn总量（支）获卵数（n）MⅡ卵数（n）基础FSH（IU/L）内膜厚度（mm）早期补救性ICSI组Half-ICSI组P 30.94±4.96 31.08±5.19＞0.05 5.98±2.60 6.42±4.01＞0.05 27.65±7.79 29.08±11.22＞0.05 10.82±4.88 9.66±5.22＞0.05 9.79±4.66 9.42±4.60＞0.05 6.56±1.51 6.81±1.29＞0.05 11.07±2.26 11.55±2.09＞0.05

2.2 两种授精方式实验室及临床资料比较

与Half-ICSI组相比，早期补救性ICSI组受精率、正常受精率、可利用胚胎率以及优质胚胎率明显升高，差异有显著性（P＜0.05或P＜0.01）；而两组在卵裂率、正常卵裂率、种植率之间无显著性差异（P＞0.05）。早期补救性ICSI组临床妊娠率较Half-ICSI组高，但差异无显著性（P＞0.05），见表2。本次研究结果显示，Half-ICSI组受精率和正常受精率明显偏低，因此对所选对象进行分析，发现在Half-ICSI组中，有26例患者卵子采用IVF-ET常规授精后完全不能受精，9例患者常规IVF-ET后有仅部分卵子受精。

表2 早期补救性ICSI组和Half-ICSI组实验室及临床各指标比较（%）

3 讨论

受精障碍是影响IVF-ET的重要因素之一，引起受精障碍的因素很多，主要包括卵子成熟不良、精卵结合异常、卵母细胞不能正常激活等。据统计，目前国内常规IVF-ET治疗中，卵母细胞受精率为60%～70%，低受精或完全不受精占整个IVF-ET周期的10%～20%[1，8]。因此，如何提高可疑受精障碍患者卵母细胞受精率及利用率，是目前IVF-ET技术发展的焦点问题。

传统的IVF-ET技术是在精卵结合后16～22 h脱去颗粒细胞，依受精情况决定是否进行补救性ICSI，但此种方法获得的可利用胚胎和优质胚胎数较少，胚胎质量较差，很难得到理想的临床妊娠率及分娩率[9]。研究发现，卵母细胞若能正常受精，则有大约90%的受精卵在加精后6 h排出第二极体[10]，据此，人们提出采用早期补救性ICSI来防止低受精或不受精。Half-ICSI授精时，由于一半受精卵被直接实施ICSI授精，另一半采用常规IVF-ET受精，若卵母细胞受精能力正常，则部分受精卵由于被实施ICSI操作而加大了治疗风险，同时也增加了患者的治疗费用；若卵母细胞受精能力低下或完全不能受精时，由于部分卵母细胞被实施常规受精而大大降低受精率，从而影响IVF-ET治疗周期的卵母细胞利用率。早期补救性ICSI采用早加精IVF，6 h后对未受精卵母细胞进行补救性ICSI，从而避免出现过多卵母细胞不受精的情况，提高了IVF-ET治疗周期的受精率，同时，能够有效降低过度使用ICSI操作带来的风险。本次研究发现，Half-ICSI组中，卵母细胞受精率超过70%的周期数为9例，占总Half-ICSI周期数的25.7%，表明这些患者卵母细胞受精能力正常却在IVF-ET治疗中由于采用Half-ICSI进行受精而被过度实施ICSI操作，增加了治疗风险。同时，通过比较两组数据发现，早期补救性ICSI组受精率、正常受精率、可利用胚胎率以及优质胚胎率均较Half-ICSI组高，表明早期补救性ICSI可明显提高可疑受精障碍患者的卵母细胞利用率，从而增加患者的移植和妊娠机会，这与吴丽敏等[11]的研究结果相符。

另有文献报道[12，13]，在体外受精精卵共培养时，高密度精子所产生的大量代谢产物以及卵周颗粒细胞合成和释放的各种细胞因子均可对卵母细胞产生细胞毒性作用，从而直接影响胚胎的后续发育、分裂以及种植，降低临床妊娠率。采用Half-ICSI授精时，部分卵母细胞需要在未拆除颗粒细胞的状态下与精子过夜共培养，使得这部分卵母细胞长时间遭受各种颗粒细胞释放因子和精子代谢产物以及活性氧的侵蚀，从而降低了胚胎的后续发育能力，另一部分卵母细胞由于被直接实施ICSI操作而处于高风险状态。早期补救性ICSI后，需在较短的时间内拆除颗粒细胞，观察卵母细胞的受精情况并将其转移到新的培养液中培养，如此则有效避免了卵母细胞或受精卵长时间承受精子和颗粒细胞的间接损伤，在很大程度上保护受精卵的后续发育能力。然而，与预期结果不同的是，本次研究数据显示，早期补救性ICSI临床妊娠率较Half-ICSI高4.11%，但却无显著性差异，这可能是由于每位患者在当次周期内仅移植2～3个胚胎，从而无法观察两种方法对患者最终妊娠结局的影响造成的。因此，要说明两种不同授精方法对临床妊娠率的影响，应对二者累积妊娠率进行比较，但本次所选部分对象在首次移植未获妊娠后未进行冷冻胚胎移植，因此，暂不讨论两种授精方法对IVF-ET最终结局的影响。

综上所述，虽然早期补救性ICSI与Half-ICSI均能提高低受精和不受精卵母细胞的受精率，但综合各因素评价，早期补救性ICSI在提高受精率、增加卵母细胞利用率以及改善患者治疗结局方面更优于Half-ICSI，是可疑受精障碍患者进行IVF-ET治疗的首选授精方式。

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