温阳通脉方对大鼠心肌缺血再灌注RISK通路机制研究※

石月萍

（辽宁医学院附属第一医院中医科，锦州 121001）

急性心肌梗死经溶栓、冠脉介入治疗可以迅速重建血流，但却伴随着心肌缺血再灌注损伤 （MIRI）的负面影响。缺血预适应减轻心肌缺血再灌注损伤成为研究热点[1]。再灌注损伤补救激酶（reperfusiong injury salvage kinase，RISK）信号通路是细胞存活的关键机制之一。已经有系列研究表明PI3K-Akt通路途径参与缺血及药物预处理及后处理对再灌注损伤的保护作用[2]。本实验研究中医经典方的加减方 （加减枳实薤白桂枝汤）温阳通脉方对大鼠缺血再灌注损伤模型心肌坏死标记物cTnT含量及心肌akt、bax、bcl-2蛋白表达的影响，探讨其心肌保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1 .1 实验动物 健康雄性SD大鼠40只，体重250g～300g，随机分为4组，每组10只 （购于辽宁医学院实验动物中心）。分别为假手术组、心肌缺血再灌注损伤组 （IR组）、心肌缺血预适应组 （IP组）、温阳通脉方组 （WY组）。

1.1 .2 药品与试剂 温阳通脉方采用全成分 （枳实、薤白、桂枝等）配方颗粒，购自北京康仁堂药业有限公司 (批号130301)。Bax、Bcl-2单克隆抗体 （北京博奥森生物技术有限公司）；DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒 （碧云天生物技术研究所）；蛋白激酶b试剂盒（北京中杉金桥试剂有限公司）；山羊抗兔IgG抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.1 .3 实验仪器 DH-150动物人工呼吸机：浙江大学医学仪器厂。BSM-7105床边监护仪：光电医用电子公司。KB超薄切片机 (EMC6型)：LEICA公司。全自动免疫组化染色仪：美国DAKOCYTOMSTION。光学显微镜：日本奥林帕斯。TWY-16G低温冷冻离心机：日本日立公司。全自动生化分析仪HITACHI7080，日本HITACHI7080公司。

1.2 实验方法

1.2 .1 实验分组及给药 WY组，每日灌胃1.5ml温阳通脉方免煎中药配方颗粒 （4.68g/kg，剂量按人体表面积的0.018计算）2周。其余各组每日灌胃生理盐水1.5ml连续2周。假手术组在大鼠末次灌胃1小时后开胸，冠状动脉前降支下置线不结扎。IR组于末次灌胃1小时建立IR模型。IP组于末次灌胃1小时后建立IP模型。WY组于末次灌胃1小时后建立IR模型。

1.2 .2 模型制备 各组大鼠，以乌拉坦 (1g／kg)腹腔注射麻醉。四肢插入针形电极，连接心电监护仪，描记Ⅱ导联心电图。气管插管，连接动物呼吸机行人工呼吸 （正压呼吸）。自左侧第一、二、三肋开胸，充分暴露心脏及其表面的血管，剪开心包膜，于左心耳根部下方2mm处进针，穿过心肌表层在肺动脉圆锥旁出针，将直径为1.5mm的凹型硅胶管置于结扎线与血管之间，当拉紧结扎线时，硅胶管压迫冠状动脉左前降支而致闭塞。IR组、WY组：结扎30min后，松解结扎线，再灌注120min。IP组：缺血5min，再灌注 5min，反复三次后，拉紧结扎线30min，然后再灌注120min。假手术组：只穿线不结扎。

冠脉结扎后左室发绀，心电图S-T段抬高和 （或）R波高耸；松开结扎线后，心肌颜色由发绀转红，抬高的S-T段和 (或)R波回落，表明心肌再灌注成功。

1.2 .3 指标检测

1.2 .3 .1免疫组织化学法检测bax、bcl-2心肌组织切片梯度乙醇脱蜡，微波热修复抗原，3%过氧化氢消除内源性过氧化酶活性，血清封闭，滴加稀释的一抗，4℃过夜，滴加二抗，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树脂封片，显微镜观察照相。每只标本随机取1张切片，每张切片高倍镜 (×400)下随机选择5个视野，采用Image-Pro Plus 6.0软件分析计算该区域阳性细胞百分率。

1.2 .3 .2 Western-Blot检测p-akt置冻存心肌组织100mg于匀浆器中，加入1ml裂解液，匀浆后，4℃15000r/min离心30min，取上清液，用考马斯亮蓝法测定蛋白定量，制成含蛋白相等的样品。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。转膜，于5%脱脂奶粉的TBS中37℃封闭120min，加入一抗，4℃封闭过夜，洗涤3次，加入二抗，37℃孵育120min，洗涤3次，滤干，按Western blot发光试剂盒说明书显影，扫描，测定各组蛋白的相对光密度值。

1.2 .4 统计学处理 所有数据以均数±标准差 （x±s）表示，统计学处理用SPSS12.0软件包。计量资料采用组间正态检验，单因素方差分析，组间多重比较采用SNK检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清心肌坏死标记cTnT含量 见表1。

表1 大鼠血清cTnT （n=10）

表1 大鼠血清cTnT （n=10）

注：与假手术组比较，△P＜0.05；与IR组比较，☆P＜0.05；与IP组比较，■P＞0.05

组别 cTnT （μg/L）假手术组 1.37±0.20 IR组 8.85±2.50△IP组 5.25±1.65△☆WY组 5.15±1.58△☆■

2.2 各组大鼠心肌组织akt表达 见表2及图1。

表2 各组大鼠心肌组织akt的表达 （n=10）

表2 各组大鼠心肌组织akt的表达 （n=10）

注：与假手术组比较，△P＜0.01，αP＞0.05；与 IR 组比较，☆P＜0.01，βP＞0.05；与 IP 组比较，■P＞0.05

组别 p-akt（×104） akt（RD） p-akt（RD）假手术组 0.80±0.12 0.42±0.07 0.20±0.03 IR组 1.53±0.22△ 0.41±0.08α 0.38±0.06△IP组 1.88±0.30△☆ 0.41±0.09αβ 0.49±0.09△☆WY组 1.83±0.38△☆■ 0.40±0.07αβ■ 0.47 ±0.09△☆■

图1 各组大鼠心肌组织p-akt表达

2.3 大鼠心肌组织bax、bcl-2表达 见表3及图2、3。

表3 各组大鼠心肌组织bax、 bcl-2表达 （n=10）

表3 各组大鼠心肌组织bax、 bcl-2表达 （n=10）

注：与假手术组比较，△P＜0.01；与IR组比较，☆P＜0.01；与IP组比较，■P＞0.05

组别 bax bcl-2假手术组 0.21±0.08 0.25±0.07 IR组 0.79±0.13△ 0.41±0.09△IP组 0.35±0.09△☆ 0.65±0.11△☆WY组 0.36±0.10△☆■ 0.66±0.14△☆■

图2 各组大鼠心肌组织bax表达

图3 各组大鼠心肌组织bcl-2表达

3 讨论

温阳通脉方由 《金匮要略》枳实薤白桂枝汤化裁而来。该方已经被历代医家及近现代中医药工作者临床实践所证实为治疗冠心病心绞痛的经典方剂。冠心病心绞痛属于中医 “胸痹”、 “心痛”等范畴。心肌梗死应为 “胸痹”重症，属于 “真心痛”范畴。心肌缺血再灌注损伤应发生于心肌梗死之后，因此其证候类似于真心痛。真心痛的病机特点是本虚标实，病位在心，本虚以心阳气虚为主，标实以痰浊、血瘀为主[3]。枳实薤白桂枝汤具有行气化痰，宣痹通阳作用，在此基础上加入补气之人参、活血化瘀之三七，则为温阳通脉方，全方具有针对真心痛病机的补气温阳化痰活血作用。

前期研究表明，温阳通脉方能够缩小心肌梗死面积，抑制细胞凋亡、改善心肌缺血再灌注损伤的作用[4]，但其具体信号通路机制尚不明确。

再灌注损伤补救激酶 （reperfusion injury salvage kinase，RISK）信号通路[5]主要包括磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K-蛋白激酶B（又称Akt）以及细胞外信号调节蛋白激酶 （ERK1/2）。已有研究表明，PI3K-Akt通路参与缺血及药物预处理及后处理对再灌注损伤的保护作用[6-8]。

PI3K定位于细胞膜上，Akt通过PI3K的产物3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇的作用使自身转移到细胞膜上磷酸化后被激活，称为依赖PI3K途径；不被转移到细胞膜上活化，称为非依赖PI3K途径。当Akt在细胞膜上被激活以后，能够向细胞质或细胞核转运，并与相应部位的底物蛋白发生作用，使底物蛋白特定部位的丝、苏氨酸发生磷酸化。激活的Akt可同时磷酸化胞质或胞核内的多种底物[9]，因此，Akt被认为是复杂网络信号通路的中心调节器[10]。

Bcl-2是AKT底物之一，能够通过不同的分子机制对线粒体介导的细胞凋亡发挥重要的调控作用。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，前者主要有Bcl-2、Bcl-X、Bcl-1、Bcl-W等，后者包括Bax、Bcl-X、Bad、Bak、Bid等，各蛋白之间可相互作用形成同源或异二聚体，构成一个复杂的调控网络。Bcl-2能和线粒体上的特异位点相结合，抑制线粒体细胞色素C的外溢，细胞色素C的释放受阻，Caspase-3活性下降进而抑制细胞凋亡[11]。

本实验观察了温阳通脉方预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌坏死标记物cTnT含量及PI3k/Akt及其下游分子Bcl-2、bax的表达影响。通过免疫组化方法检测大鼠心肌缺血再灌注后心肌组织中Bcl-2、bax蛋白表达，采用免疫印迹方法检测各组Akt和p-akt的表达，观察到模型组大鼠心肌组织中Bcl-2、bax蛋白表达水平均明显增加，表明心肌缺血再灌注后促凋亡蛋白表达增加，而抑制凋亡蛋白表达也增加。各组Akt表达量相当，而P-akt表达增加，说明再灌注损伤激活了RISK途径，使Akt磷酸化，从而上调抑制凋亡蛋白bcl-2的表达。而温阳通脉方与预处理组的p-akt表达量明显高于IR组，使bcl-2蛋白表达增加，bax蛋白表达降低，发挥了内源性保护机制。药物干预组温阳通脉方的p-akt、bcl-2、bax的表达量与预适应组的表达量相当，说明其可能具有类似预适应样的作用。

本研究结果表明：温阳通脉方能够降低心肌坏死标记物的含量，能够上调心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞表达p-akt、bcl-2，降低bax蛋白表达，说明温阳通脉方对大鼠急性心肌缺血引起的心肌损伤具有保护作用，其机制可能通过预适应样作用，上调内源性保护因子p-akt，从而上调bcl-2，抑制bax蛋白表达有关。

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