基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在临床微生物检测和鉴定中的应用

宗玉龙，曹 源，褚芳波，张萍萍 综述 胡成进 审校

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在临床微生物检测和鉴定中的应用

宗玉龙1，曹 源2，褚芳波1，张萍萍1综述 胡成进2审校

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；微生物；检测；鉴定

现今临床主要通过观察细菌菌落形态、革兰染色、显微镜检查，以及各种生化试验等方法对致病菌进行检测和鉴定。这些方法主要依赖致病菌的生长代谢，其周期较长，并且带有一定的主观性[1]，不能满足临床上对致病菌进行快速诊断的需要。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-fight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)的诞生和发展奠定了用蛋白质指纹图谱鉴定微生物的基础。通过检测未知微生物的蛋白质指纹图谱并与质谱图数据库中特征性谱图进行比对，从而对待测微生物进行快速鉴定。该技术具有速度快，灵敏度高，操作简单，信息直观，成本低廉等特点，在对病原微生物进行快速鉴定方面具有良好的应用前景。

MALDI-TOF MS 仪器主要由基质辅助激光解吸离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)两部分组成。其基本原理是用一定强度的激光照射基质与样品形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，将能量传递给样品，使样品解吸附，样品和基质之间发生电荷转移从而使样品发生电离，电离的样品在电场的作用下加速飞过飞行管道，并被检测器检测。不同离子的飞行时间与其质量电荷比值成正比。完整的细菌可以产生特定的蛋白指纹图谱，通过和数据库中的图谱进行比对可以对未知微生物进行鉴定。

1 检测和鉴定细菌

近年来，用MALDI-TOF MS 鉴定细菌的报道不断增加，显示出这一技术在临床病原菌鉴定中广阔的应用前景。MALDI-TOF MS 已被证明是鉴定细菌和酵母菌准确、快速、经济的方法[2]。Bizzini等[3]对使用MALDI-TOF MS 的方法和传统方法鉴定临床分离细菌和酵母菌方法进行了比较，用MALDI-TOF MS 的方法鉴定1371株已经用传统方法鉴定完成的临床分离株，其中，1278株(93.2%)可以鉴定到种的水平，73株(5.3%)可以鉴定到属的水平，不能够准确鉴定的有20株(1.5%)；在被鉴定到种的水平的1278株菌中，有63(4.9%)株的鉴定结果与传统方法的鉴定结果不一致，其中绝大多数(42/63)不一致的结果是由系统数据库相关分类的差异造成的，14株是由质谱仪的分辨率较低造成的，另外的7株是由于传统方法的鉴定错误。这些结果表明，MALDI-TOF MS 具有取代使用传统表型鉴定方法鉴定微生物的潜力。

Van Veen等[4]对980株临床分离细菌和酵母菌进行了前瞻性实验研究，结果表明，MALDI-TOF MS 对菌株进行准确鉴定的准确性要高于传统的生化方法(92.2%和83.1%)。MALDI-TOF MS 可以准确鉴定97.7%的肠杆菌科，92%发酵型革兰阴性杆菌，94.3%的葡萄球菌，84.8%的链球菌及85.2%的酵母菌。对于混合细菌的指纹图谱，Mahé等[5]使用了一种依赖物种特异性的非负线性回归模型，这样可以从常规参考数据库中得到单一细菌的信息，从而检测样品中哪种细菌存在。其结果表明，这种方法可以自动的检测混合样品中含有哪种细菌，使用这种方法可以鉴定约61.2%的样本，其错误鉴定率约为5.3%。

2 检测和鉴定真菌

近年来，因酵母或酵母样真菌所造成的重度感染逐渐增多，尤其多见于免疫功能不全的患者[6]。与用质谱鉴定细菌相比，用质谱的方法鉴定真菌的报道相对较少。这是因为真菌细胞壁硬度较大，对真菌或者其孢子进行机械或者化学处理的方法虽然可以增加其表面蛋白的释放，有利于真菌的鉴定，但与将细菌直接进行质谱测定相比，其耗时较长，且效率较低[6-8]。不过与传统的生物学或生物化学的鉴定方法相比，MALDI-TOF MS 还是有许多优势。Bader和Weig[9]用MALDI-TOF MS 的方法鉴定了1192株酵母菌和类酵母真菌，并将鉴定结果与传统的镜检和生化测定方法的结果进行了比较，二者均可以准确鉴定95.1%的临床分离株，但质谱法错误鉴定的发生率要比传统方法低很多，此外，质谱法还可以鉴别种属关系较接近的菌种，这是MALDI-TOF MS 比传统鉴定方法的一大优势。

MALDI-TOF MS 已经成功鉴定了多种真菌，如曲霉属真菌、镰刀菌属、青霉菌，以及临床分离的不同酵母菌[10]。Marklein等[6]用MALDI-TOF MS 的方法鉴定了267株临床分离的酵母菌和类酵母真菌，247(92.5%)株得到了准确的菌种鉴定结果。Tan等[2]准确鉴定了952株临床分离株中的128株酵母菌分离株。Bille等[11]用MALDI-TOF MS 鉴定酵母菌和曲霉属真菌的准确率分别为98.8%(160/162)和98.4%(63/64)。

3 检测细菌耐药性

对抗生素耐药的细菌近年来逐年增多，耐药菌给重症患者尤其是术后以及血液系统肿瘤的患者的感染治疗带来较大困难[12]。2000年，Edwards-Jones 等[13]用MALDI-TOF MS 的方法将金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药株和敏感株区分开来，随后2002年，Du等[14]进一步证明了此结论。现今，对细菌耐药性的检测主要集中在以下几个方向：检测降解酶对抗生素的修饰、通过对多重耐药菌的蛋白质组学研究其耐药机制的决定因素以及对某些靶位点如核糖体甲基化位点的分析[15]。Jung等[16]用MALDI-TOF MS 的方法快速检测抗β-内酰胺类抗生素的肠杆菌科细菌。通过检测100例经血培养得到的抗三代头孢霉素的肠杆科细菌所表达的β-内酰胺酶，并用传统方法对检测结果进行了验证，用MALDI-TOF MS 的方法鉴定青霉素敏感株和耐药株的敏感性和特异性均为100%。rRNA甲基化产生合成抗氨基糖苷类、氯霉素、克雷霉素的蛋白[17]，MALDI-TOF MS 的方法可以检测rRNA的修饰[18]，将RNA用核酶降解后进行质谱检测，将检测结果与理论上的结果相比较，以检测哪些核酸序列发生了修饰。多重耐药菌的蛋白质组学研究依赖于对耐药株主要耐药蛋白的蛋白指纹图谱库的建立，用这种方法鉴定耐药株还需要进一步的优化与论证。用MALDI-TOF MS 技术鉴定细菌耐药性还成功用于鉴定碳青霉烯类抗生素耐药的细菌[19]，多重耐药的肺炎克雷伯菌等[20]。

4 MALDI-TOF MS应用评价及展望

4.1 主要优点 用MALDI-TOF MS 的方法鉴定病原菌具有以下优点：(1)操作简单，某些细菌只需将单个菌落涂抹于靶板上，某些细菌的前处理需要先提取蛋白，检测过程可通过提前设置好的自动化鉴定程序完成，测定得到的质谱图经软件分析，打分后给出鉴定结果; (2)耗时较短，鉴定一个样品需要5～10 min，这比传统的方法具有很大的优势。Tan等[2]评估了临床实验室鉴定细菌和真菌的时间，用MALDI-TOF MS 的方法平均要比传统的鉴定方法提前1.45 d。(3)费用低廉，MALDI-TOF 设备单次试验检测费用在$0.35 和 $0.79之间。Seng等[21]发现用MALDI-TOF MS 方法鉴定细菌的成本约占传统鉴定方法成本的22%到32%。

4.2 应用局限性 作为一种相对较新的细菌鉴定方法，MALDI-TOF MS 存在一些局限性。主要体现在：(1)数据库还有待于进一步的完善，现今MALDI Biotyper数据库仅有不到4000种微生物的指纹，远远不能满足临床阳性检出率和检测准确度的要求，数据库还有待于进一步扩充;(2)对大多数病人标本中的病原菌，MALDI-TOF MS 并不能进行直接的鉴定，还需要对标本进行培养。但对于病原菌含量较多的标本可以直接进行鉴定;(3)对耐药菌株的检测，MALDI-TOF MS 的方法也有一定的局限性。其对一些格兰阴性耐药菌的检测效果较差，如肺炎链球菌和缓症链球菌可以产生相似的16 S RNA蛋白，所以其蛋白谱图也相似，这对链球菌的鉴别带来了困难[1]。

4.3 展望 MALDI-TOF MS 方法简便、快捷、经济的优势是其在临床微生物检测领域具有极其广阔的应用前景，虽然其对一些样本的鉴定还存在些许的局限性，相信随着质谱效果好，重复性高的通用试验试验方法的建立，以及质谱图数据库的建立和质谱技术的发展，MALDI-TOF MS 的方法必将成为临床微生物鉴定的重要工具。

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(2014-04-21收稿 2014-05-28修回)

(责任编辑 岳建华)

全军十二五重点基金资助项目 (BWS12J014)

宗玉龙，硕士研究生，E-mail:zongyulong88@126.com

1. 121001锦州，辽宁医学院研究生学院；2. 250031济南，济南军区总医院实验诊断科

胡成进，E-mail:hcj6289@163.com

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