上皮间质转化在原发性肝癌侵袭、转移中的作用

胡彦建，韩明子，胡彦华

哈尔滨医科大学附属第二医院1.消化内科;2.普外科，黑龙江 哈尔滨 150086

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球常见恶性肿瘤之一，全球每年的肝癌新发病例数为74.8万，死亡例数为69.6 万[1-2]，在所有癌症导致的死亡中肝癌居于第3位[3]。HCC症状不明显，早期诊断率较低，5年生存率＜5%，确诊时多数已发展为中晚期，发生远处扩散转移[4]。因此，研究HCC侵袭转移的发生机制，对改善肝癌患者预后、延长患者生存期，具有重要的意义。近来，已有相当多的证据表明，上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肝癌侵袭、转移的关键[5]，其在肝癌的侵袭、转移过程中发挥着极其重要的作用。

1 EMT及其诱导调控因素简述

1.1 EMT简述 EMT是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转化的现象，在此过程中上皮细胞失去细胞极性、丢失细胞间紧密连接和黏附连接，获得了浸润性和游走迁移能力，变成了具有间质细胞功能和特性的细胞。1982年Garry等初步证明上皮细胞会在特定的因素下暂时丧失其细胞极性，表现出具有移行能力的间质细胞特性，提出了 EMT的概念[6]。EMT在胚胎发育时发生，参与了胚胎发育的各个阶段，它在发育的初级阶段参与了原肠胚、神经嵴的形成，次级阶段参与了胰腺、肝脏和生殖道的形成，第3阶段参与心脏重构。EMT除在胚胎发育中发挥作用，也参与组织损伤修复，例如上皮组织的伤口愈合过程中，增生的上皮细胞移行到伤口部位进行修复的过程，也是一种EMT[7]。EMT是一种瞬时、可逆的过程，主要特征包括:(1)细胞黏附相关分子E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达降低，导致细胞黏附减弱，细胞分散;(2)细胞骨架重排，由角蛋白骨架变成波形蛋白骨架;(3)上皮细胞由原来排列紧密的圆形或方形细胞变为排列松散的梭形细胞形态[8];(4)纤维原细胞或间质细胞的特性的获得，例如:波形蛋白(vimentin)、纤连蛋白(fibronectin)、Snail、Twist、Slug 及其它间质标记蛋白的表达上调。在既往研究中花了很长时间才意识到EMT是恶性肿瘤进展的可能原因，主要是因为在肿瘤中EMT现象很难在时间和空间上得到追踪。然而在体外实验中，许多肿瘤细胞株经历了部分或完全的EMT现象，而且癌细胞在发展过程中丢失了上皮细胞的特征，表现出细胞形态的多形性和恶性的潜能。近年来调控EMT的机制逐渐被阐明，许多在胚胎发育和肿瘤进展中常见的信号途经已经得到证实。研究EMT的发生和调控机制，对于寻找治疗恶性肿瘤特别是肿瘤细胞侵袭、转移的目标靶点具有重要意义。

1.2 EMT诱导调控因素 目前已知参与诱导及调控细胞发生EMT的因素很多。包括:(1)生长因子的诱导。细胞外信号可以诱导上皮细胞发生EMT，这些细胞外信号包括多种细胞因子和生长因子，以及缺血、缺氧等，其中生长因子在诱导肿瘤细胞发生EMT中的作用尤其受到关注，如转化生长因子(transforming growth factor beta ，TGF-β)、肝细胞生长因子(hepatic growth factor，HGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等[9-10];(2)转录因子的调节。转录因子作为EMT调控过程中的下游因素，通过抑制E-cadherin的转录水平，下调其表达，导致上皮细胞向间质细胞表型的转变。其中包括 Snail、Slug、Twist、ZEB1、Smad及核转录因子-kB(nuclear factor kappaB，NF-kB)[11-13]等转录因子。(3)信号通路的调控。新近研究通过构建细胞系模型，发现许多信号通路可以调控EMT，如TGF-β信号途径、磷脂酰肌醇3-激酶 (Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB又称AKT)通路、Ras/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路、Wnt(wingless-type)/β-catenin通路、Notch信号通路及Hedgehog通路等[14-17];EMT的信号调控是个相当复杂的网络，不但调控信号通路较多，而且不同的信号之间还存在着相互关联。近来也有研究发现MicroRNA(miRNA)在EMT调控中也发挥重要作用[18-19]。以上因素与EMT有着密切的关系。此外，EMT发生还与细胞骨架、细胞外基质以及细胞间连接方式的改变相关。

2 EMT在原发性肝癌侵袭、转移中的作用

肝癌侵袭、转移涉及细胞黏附、运动、增殖、细胞外基质的降解、机体免疫与肿瘤血管生成等环节，其分子机制主要有:与侵袭相关的抑癌基因的失活和癌基因的表达增加、与转移有关的细胞因子及其受体表达水平的变化、基质金属蛋白酶异常表达、肿瘤微血管密度的影响等。人们在原发性肝癌的细胞及动物模型、临床研究中发现了EMT现象，且EMT的发生与肝癌侵袭、转移密切相关。本文将详述从不同途径诱导及调控肝癌细胞发生EMT对肝癌侵袭、转移的作用。

2.1 微环境(低氧) 侍晓辰等[20]观察低氧环境下2种具有不同侵袭、转移能力的人肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2发生EMT情况和侵袭、转移能力的改变。其结果显示:低氧环境中，该2种肝癌细胞均由原来的紧密排列上皮样状态转为较松散的纺锤体样改变;Western blotting检测显示，2种肝癌细胞株的E-cadherin表达量明显下降，而Vimentin表达量明显升高;Transwell迁移、侵袭实验显示，2种肝癌细胞的迁移、侵袭能力明显增强;SMMC-7721细胞的上述变化均较HepG2细胞明显。上述说明低氧环境可诱导肝癌细胞发生EMT，促进肝癌细胞形态改变，引起细胞功能变化，并增强肝癌细胞的迁移、侵袭能力，促进肝癌细胞发生远处转移;转移能力较强的细胞发生的上述变化更明显。

2.2 生长因子 王波等[21]应用TGF-β1诱导肝癌细胞SMMC-7721，动态观察细胞形态学变化，Western blotting和免疫荧光检测EMT相关E-cadherin的表达，通过流式细胞仪分析TGF-β1诱导前后Side population(SP)细胞含量的变化。研究结果显示:加入TGF-β1后，SMMC-7721细胞的形态发生改变。免疫荧光提示定位于胞质的表达阳性细胞明显减少，Western blotting检测提示其蛋白表达明显下调，说明TGF-β1能够诱导肿瘤细胞系发生EMT，从而在肝癌侵袭、转移过程中起到重要作用。另外 TGF-β1诱导 SMMC-7721细胞发生EMT后，SP细胞比例分别从未诱导前的4.3%降低到诱导后的0.1%，分析其可能的机制，推测EMT状态的诱导和维持在一定程度上抑制了肿瘤干细胞的增殖，促进了肿瘤细胞向侵袭和转移方向发展。王庆军等[22]用 HGF处理肝细胞癌 SMMC-7721后，应用细胞培养、Transwell、划痕实验、Western blotting技术研究HGF对肝癌细胞SMMC-7721上皮-间叶转化的作用。并应用PI3K抑制物LY29400210 μmol/L预处理细胞，观察SMMC-7721的变化，研究PI3K对于HGF作用机制的影响。结果显示:Transwell和划痕实验显示HGF处理的细胞侵袭和转移能力增强，蛋白印迹结果显示HGF处理的细胞的道N-钙黏蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和 Vimentin的表达增加，E-cadherin的表达减少。LY294002预处理后，细胞不再受HGF的影响，细胞的形态没有明显变化，Transwell和划痕实验结果与未经处理的SMMC-7721相同。蛋白印迹结果显示:细胞的 N-cadherin、MMP-2、MMP-9、Vimentin和E-cadherin的表达变化不明显。说明HGF能够增强SMMC-7721的EMT能力，能够增强肝癌细胞SMMC-7721侵袭和转移能力，降低细胞的黏附能力，其机制与PI3K有关。

2.3 转录因子 卢倩等[23]利用重组腺病毒载体pAdEasy-SNAIL高效感染HepG2肝癌细胞株，诱导外源性Snail1蛋白过表达，以空载腺病毒pAdEasy-GFP作为对照。利用RT-PCR、Western blotting和细胞免疫组织化学的方法，检测转染后HepG2细胞Snail1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的mRNA转录和蛋白表达水平。随机运动实验及侵袭实验检测HepG2细胞转染目的基因后运动侵袭能力的改变。其结果显示:(1)pAdEasy-SNAIL高效感染HepG2细胞，与对照组相比SNAILmRNA和Snail1蛋白表达均显著增强，Snail1蛋白在胞浆和胞核着色明显强化。(2)实验组HepG2细胞，在mRNA和蛋白水平表达 E-cadherin均显著受到抑制，N-cadherin、Vimentin表达则明显上调。(3)实验组随机运动实验中各观察时相点细胞空白区均小于对照组;侵袭实验中，实验组穿膜细胞数多于对照组。说明了外源性Snail1蛋白过表达能诱导HepG2细胞出现EMT样变化，能够增强肝癌细胞运动、侵袭能力。Yang 等[24]发现，与 Snail、Twist低表达的肝癌 Huh-7细胞相比，Snail、Twist高表达的肝癌Mahlavu细胞具有更强的侵袭、转移能力。而在肝癌的动物模型中，过表达Snail/Twist，不仅可以促进EMT的发生，还能提高肝癌细胞的转移能力;相反，沉默Snail/Twist，肝癌细胞的转移能力得到了抑制。上述结果说明了EMT可能通过其转录因子Snail/Twist促进肝癌侵袭和转移的发生。陈嫱等[25]通过收集97例肝细胞肝癌标本及临床病理资料，利用CD31标记肝细胞肝癌微血管密度(microvessel density，MVD)，应用免疫组织化学染色检测Twist1和MMP-9的表达，分析其表达与MVD及临床病理指标之间的关系。结果显示:临床分期Ⅲ～Ⅳ期的MVD高于Ⅰ～Ⅱ期，转移组的MVD高于非转移组，差异均有统计学意义;Twist1浆表达、Twist1核表达、MMP-9表达阳性患者的MVD高于阴性表达患者，Twist1浆表达、Twist1核表达、MMP-9表达阳性细胞率与MVD呈正相关。这说明肝细胞肝癌MVD的增高伴随Twist1及MMP-9的高表达。表明肿瘤细胞表达Twist1预示着肿瘤局部MVD会增高，即发生EMT的肝细胞肝癌拥有更强的血管生成能力。而肿瘤细胞表达Twist1又可以增强MMP-9的活性，进而促进内皮细胞的增殖、迁移和细胞外基质重塑，改善局部微循环，使得肿瘤生长和演进。

2.4 信号通路 许秋然等[26]收集63例肝细胞癌组织及相对应的癌旁组织应用免疫组化，RT-PCR法检测胶质瘤相关癌基因1(Gli1)在肝细胞癌及癌旁组织中的表达情况，同时应用免疫组化法检测Hedgehog信号通路配体sonic hedgehog(Shh)、EMT标记物 Vimentin以及 E-cadherin癌旁组织中的表达情况，使用Mann-Whitney U检验分析肝细胞癌组织与癌旁正常组织Gli1的mRNA含量以及蛋白表达差异。使用卡方检验分析Gli1蛋白在肝细胞癌组织中的表达与患者临床特征的关系。使用 Spearmen秩检验分析肝细胞癌组织中Gli1蛋白表达分别与Shh、Vimentin及 E-cadherin这3种蛋白表达的关系。结果显示，肝细胞癌组织中Gli1蛋白及mRNA含量明显高于癌旁正常肝组织;Gli1蛋白表达分别与肿瘤肝内转移或淋巴结转移、高Edmonson病理分级以及TNM肿瘤分期较晚有关;肝细胞癌组织中Gli1蛋白表达与Shh、Vimentin蛋白表达呈明显正相关，而与E-cadherin蛋白呈负相关。说明Gli1可能在Shh配体的作用下激活Hedgehog信号通路诱导EMT的发生，并可能促进肝癌侵袭、转移的发生。Wang等[27]通过siRNA干扰等技术，证实Notch1-Snail1-E-cadherin途径影响肝癌细胞的侵袭、转移。最后，对临床肝癌组织进行了相关验证，证实Notch1高表达的患者中67% 的Snail1高表达，同时伴有E-cadherin的低表达，这一结果与肝癌细胞株实验研究相符，即Snail1和E-cadherin与Notch1具有相关性。Lim等[28]报道Notch受体蛋白的活性形式即胞内域(NICD)通过与锌指转录因子Snail的结合能够抑制其蛋白的表达，在一定情况下Notch信号通路与Snail功能存在拮抗。上述二者说明了EMT也可能通过Notch信号通路促进肝癌侵袭、转移的发生。综上所述，EMT在肝癌侵袭、转移过程中发挥着重要的作用。

3 展望

原发性肝癌是世界范围内发病率及致死率最高的恶性肿瘤之一，与其他恶性肿瘤一样，肝癌的复发、转移是其治疗失败的主要原因。而目前对EMT在原发性肝癌侵袭、转移中的作用，已成为国内外研究的热点，但其确切机制并不明确，仍需有待研究。

[1]Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61(2):69-90.

[2]Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.Cancer statistics，2011:the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].CA Cancer J Clin，2011，61(4):212-236.

[3]Schiffman SC，Woodall CE，Kooby DA，et al.Factors associated with recurrence and survival following hepatectomy for large hepatocellular carcinoma:a multicenter analysis[J].J Surg Oncol，2010，101(2):105-110.

[4]Pak SI，Chang KS.Performance estimation of a Venturi scrubber using a computational model for capturing dust particles with liquid spray[J].J Hazard Mater 2006，138(3):560-573.

[5]Van Zijl F，Zulehner G，Petz M，et al.Epithelial-mesenchymal transition in hepatocellularcarcinoma [J].Future Oncol，2009，5(8):1169-1179.

[6]Greenburg G，Hay ED.Epithelia suspended in collagen gels can lose polarity and express characteristics of migrating mesenchymal cells[J].Cell Biol，1982，95(1):333-339.

[7]Lee JM，Dedhar S，Kalluri R，et al.The epithelial-mesenchymal transitions in development and disease [J].Cell，2009，139(5):871-890.

[8]Boyer B，Valles A M，Edme N.Induction and regulation of epithelialmesenchymal transitions [J].Biochem Pharmacol，2000，60(8):1091-1099.

[9]Acevedo VD，Gangula RD，Freeman KW，et al.Inducible FGFR-1 activation leads to irreversible prostate adenocarcinoma and an epithelial-to-mesenchymal transition [J].Cancer Cell，2007，12(6):559-571.

[10]Sethi N，Kang Y.Unravelling the complexity of metastasismolecular understanding and targeted therapies[J].Nat Rev Cancer，2011，11(10):735-748.

[11]Moody SE，Perez D，Pan TC，et al.The transcriptional repressor Snail promotes mammary tumor recurrence[J].Cancer Cell，2005，8(3):197-209.

[12]Fu J，Chen Y，Cao J，et al.p28GANK overexpression accelerates hepatocellular carcinoma invasiveness and metastasis via phosphoinositol 3-kinase/AKT/hypoxia-inducible factor-1alpha pathways[J].Hepatology，2011，53(1):181-192.

[13]Julien S，Puig I，Caretti E，et al.Activation of NF-kappaB by Akt upregulates Snail expression and induces epithelium mesenchyme transition[J].Oncogene，2007，26(53):7445-7456.

[14]Qi MH.Signal pathways associated with epithelial-mesenchymal transition in metastasis of primary hepatocelluar carcinoma[J].World Chinese Journal of Digestology，2012，20(11):953-958.齐明华.上皮间质转化及相关信号通路在原发性肝细胞癌转移中的研究进展[J].世界华人消化杂志，2012，20(11):953-958.

[15]Avila MA，Berasain C，Sangro B，et al.New therapies for hepatocellular carcinoma[J].Oncogene，2006，25(27):3866-3884.

[16]Leong KG，Niessen K，Kulic I，et al.Jagged1-mediated Notch activation induces epithelial-to-mesenchymal transition through Slug-induced repression of E-cadherin[J].Exp Med，2007，204(12):2935-2948.

[17]Whittaker S，Marais R，Zhu AX.The role of signaling pathways in the development and treatment of hepatocellular carcinoma[J].Oncogene，2010，29(36):4989-5005.

[18]Cottonham CL，Kaneko S，Xu L.miR-21 and miR-31 converge on TIAM1 to regulate migration and invasion of colon carcinoma cells[J].J Biol Chem，2010，285(46):35293-35302.

[19]Tsuji T，Ibaragi S，Hu GF.Epithelial-mesenchymal transition and cell cooperativity in metastasis[J].Cancer Res，2009，69(18):7135-7139.

[20]Shi XC，Zhang WD.Influence of hypoxia on epithelial-mesenchymal transition and migratory and invasive ability of hepatocellular carcino-ma cells[J].Chinese Journal of General Surgery，2012，21(7):816-820.侍晓辰，张卫东.低氧对肝癌细胞上皮间质转化及侵袭转移能力的影响[J].中国普通外科杂志，2012，21(7):816-820.

[21]Wang B，Xia YJ，Wei Y，et al.Regulation of side population cells by TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma cell lines SMMC-7721 and HepG2 [J].World Chinese Journal of Digestology，2010，18(23):2416-2421.王波，夏羽佳，晏维，等.TGF-β1诱导的上皮间质转化对肝癌细胞系中边缘群细胞的调控[J].世界华人消化杂志，2010，18(23):2416-2421.

[22]Wang QJ，Sun S，Li HD，et al.Effect of hepatocellular growth factor on the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma[J].World Chinese Journal of Digestology，2008，16(28):3152-3156.王庆军，孙抒，李宏丹，等.肝细胞生长因子对肝细胞癌侵袭和转移的影响[J].世界华人消化杂志，2008，16(28):3152-3156.

[23]Lu Q，Yan J，Xiong Y，et al.Exogenous overexpression of Zinc O finger transcription factor Snail1 can induce epithelial mesenchymal transition in HepG2 cell line[J].Journal of Clinical Medicine in Practice，2009，13(5):24-29.卢倩，闫军，熊燕，等.Snail1外源性过表达诱导HepG2细胞上皮间叶样表型转化的实验研究[J].实用临床医药杂志，2009，13(5):24-29.

[24]Yang MH，Chen CL，Chau GY，et al.Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology，2009，50(5):1464-1674.

[25]Chen Q，Sun BC.Expression and significance of Twist1，MMP-2 and MMP-9 in hepatocellular carcinoma angiogenesis[J].Tianjin Med J，2011，39(3):193-195.陈嫱，孙保存.Twist1、MMP-2及MMP-9在肝细胞肝癌血管生成中的表达及意义[J].天津医药，2011，39(3):193-195.

[26]Xu QR，Zheng X，Zan XF，et al.Gli1 expression and its relationship with the expression of Shh，Vimentin and E-cadherin in human hepatocellular carcinoma[J].Chin J Cell Mol Immunol，2012，28(5):536-543.许秋然，郑鑫，昝献峰，等.胶质瘤相关癌基因1在肝细胞癌中的表达及其与Shh、Vimentin、E-cadherin蛋白的相关性研究[J].细胞与分子免疫学杂志，2012，28(5):536-543.

[27]Wang XQ，Zhang W，Lui EL，et al.Notch1-Snail1-E-cadherin pathway in metastatic hepatocellular carcinoma[J].Int J Cancer，2012，131(3):E163-E172.

[28]Lim SO，Kim HS，Quan X，et al.Notch1 binds and induces degradation of Snail in hepatocellular carcinoma [J].BMC Biol，2011，9:83.