泛素蛋白酶体系统与大肠癌

陈世敏，王启栋 综述 胡成进 审校

泛素蛋白酶体系统与大肠癌

陈世敏1，王启栋2综述 胡成进1审校

泛素蛋白酶体系统；大肠癌；发生发展；预后

泛素蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system，UPS)，是哺乳动物细胞内主要的蛋白质调控系统，可高效并高度选择性地进行细胞内蛋白质的降解，参与和调控多种细胞生物学过程，如细胞周期、基因转录、抗原提呈、细胞分化和凋亡等，对维持细胞的正常生理功能具有重要意义[1]。目前发现的许多遗传性和获得性疾病(如肿瘤、囊性纤维化)的发生都与该系统功能失调有关。同时，随着一些与泛素蛋白酶体途径相关致病蛋白被发现，探讨通过调控该途径进行大肠癌等相关疾病的治疗也逐渐受到人们的关注，并已成为一个热门领域。

1 泛素蛋白酶体系统的组成及功能

泛素蛋白酶体系统由泛素(ubiquitin，Ub)、泛素活化酶(ubiquitin activaing enzyme，E1)、泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzymes，E2)、泛素连接酶(ubiquitin ligating enzyme，E3)和蛋白酶体(proteosome)组成[2]。泛素蛋白酶体系统介导的蛋白质降解实际上是泛素活化酶E1、泛素转移酶E2和泛素蛋白连接酶E3参与的多步酶促反应，在目的蛋白底物的特异性氨基酸残基上加上泛素，完成蛋白底物(主要是细胞自身产生的蛋白)的泛素化，然后再通过26S蛋白酶体的催化，使其变成短肽片段。

1.1 泛素 泛素是由76个氨基酸组成的高度保守的小分子蛋白，是泛素蛋白酶体系统的重要组分。泛素具有标签样作用，通过共价结合到靶蛋白上而引起蛋白的特异性降解。泛素包含7个参与泛素连接的赖氨酸受体，能产生不同拓扑结构、不同长度和功能的泛素链[3]。 例如，泛素链通过泛素48位赖氨酸的结合导致被修饰底物的蛋白酶体降解，而63位赖氨酸的泛素连接却意味着信号转导或者运输事件。

1.2 泛素活化酶E1 泛素活化酶是泛素与底物蛋白结合所需的第一个酶。利用水解ATP释放的能量与泛素的羧基末端的甘氨酸残基形成高能硫酯键而激活泛素，为细胞的活性和生存所必需[2]。

1.3 泛素结合酶E2 泛素结合酶是泛素与底物蛋白结合所需的第二个酶。通过转酰基作用将活化的泛素进一步转移到泛素结合酶特异的半胱氨酸残基上形成Ub-E2中间体[2]。目前已识别的参与UPS的E2酶至少有50个以上。

1.4 泛素连接酶E3 泛素连接酶是泛素与蛋白底物结合所需的第三个酶，能特异性识别底物蛋白，使底物蛋白发生选择性泛素化。泛素可以直接从E2转移给特定的靶蛋白形成泛素-蛋白复合物，而在大多数情况下，靶蛋白先与泛素连接酶特异性结合，E3可使E2和靶蛋白相互接近，继而泛素从E2酶转移到靶蛋白的赖氨酸残基上，完成靶蛋白的泛素化[1,2]。多个泛素分子重复地附加到靶蛋白上，则形成多Ub链蛋白质。

1.5 蛋白酶体 蛋白酶体是由多个亚单位组成的蛋白酶复合体，沉降系数为26S，故又称26S蛋白酶体。主要负责对多聚Ub链蛋白质的识别和降解。26S蛋白酶体组成包括20S催化颗粒、11S调控因子和2个19S调节颗粒，是ATP依赖性蛋白水解酶复合体[4]。在UPS中，各种泛素化的靶蛋白质先被26S蛋白酶体的19S亚单位识别，随后泛素化靶蛋白脱泛素链和变性，进入20S亚单位的筒状结构内被降解为短肽片段。

2 UPS与大肠癌的发生发展

真核细胞内大多数蛋白质降解过程的调控是通过UPS进行的。近年来随着对UPS研究的深入，发现其不仅在真核细胞增殖、凋亡、血管生成、运动等正常生理过程中起着重要的作用，而且该系统异常造成细胞内重要功能蛋白质的降解失常与恶性肿瘤的发生和发展有着密切的关系。

2.1 UPS调控结肠上皮细胞的增殖和分化 Wnt信号途径在大肠癌发展中起重要作用，调控大肠癌上皮细胞的增殖和持续更新。研究表明，约90%的大肠癌发生与该通路过度激活有关[5]。泛素蛋白酶体系统在Wnt信号转导途径中起着重要调控作用。已经明确有多个E3泛素连接酶参与该调控过程[7]。经典Wnt信号转导途径致癌的关键是该途径任何一个信号分子异常致β-catenin在胞质中累积，继而进入核内激活TCF-4 (T cell factor-4,TCF-4)转录因子，启动靶基因转录，因此经典Wnt信号转导途径又称为Wnt/β-catenin信号转导途径。Wnt信号在结直肠上皮细胞和癌病变中的重要作用可能还来自另外一个Wnt调控转录因子Hath1。Hath1是基本的螺旋-环-螺旋转录因子能促进大肠癌上皮细胞的分化和胃肠道杯状细胞的黏蛋白产出，在反向β-catenin 路径中受蛋白酶体降解调控。Wnt信号推进GSK3β(为了后续的泛素化参与β-catenin磷酸化) 远离β-catenin的平衡并磷酸化Hath1，使之随后泛素化并被蛋白酶体降解[8]。总之，UPS在转录因子β-catenin和Hath的作用发挥上起关键作用，指导两条不同的转录程序并调控结直肠上皮细胞的增殖与分化。

2.2 UPS调控结直肠发病机制的常见损害 在导致大肠癌病变的诸多分子损害中，主要包括APC(adenomatous polyposis coli，APC)基因突变，激活β-catenin的转录，k-ras基因突变和Smad4(DPC4)基因突变。这些与大肠癌癌变相关的改变都是在UPS的调控下进行的[9]。

APC突变是正常上皮向病理损害过渡的主要事件之一。APC是履行β-catenin磷酸化复合物的组成部分，而β-catenin的磷素化是为了转录因子的泛素化从而被蛋白酶体识别而降解。

大肠癌中k-ras突变的激活引发数个致癌基因转导途径的激活。Raf激酶被k-ras触发激活MAPK级联反应导致转录因子AP1的激活。转录因子c-jun和c-fos的组成和ERK3级联激酶是蛋白酶体底物。PI3K激酶也是k-ras的激活靶标，它的活化能导致akt激酶的激活。Akt是mdm2 (p53的E3连接酶), Bad (bcl-2家族的抗凋亡成员),caspase 9和GSK3β激酶以及转录因子FKHR等众多靶标的丝氨酸/苏氨酸激酶[6]。通过这些靶标效应，akt抑制凋亡，促进增殖。akt和磷酸酯酶PTEN及其抑制药都是蛋白酶体底物。

Smad4是TGFβ信号途径的传感器，频繁地参与到大肠癌的发病机制中，也是蛋白酶体的作用底物。大肠癌中另一个肿瘤抑制因子p53突变以及p53的同家族蛋白质p73和p53的辅因子ASPP/53BP2也是蛋白酶体底物。

由此可知，蛋白酶体在不同水平通过多个途径调控大肠癌的病变。

2.3 UPS组成和底物是大肠癌的预后因子 考虑到UPS在多种结直肠癌变过程中的重要角色，对于该系统的组成和蛋白底物在不同侵袭性大肠癌病例个体差异表达并提供预后信息应不足为奇。

β-转导重复蛋白 (β-Transducin repeat-Containing Protein，β-TrCP)是涉及到β-catenin 蛋白酶体降解的E3连接酶。β-TrCP还是β-catenin /TCF4转录的靶基因，在大肠癌患者APC突变激活β-catenin的情况下，β-TrCP表达上调并且使蛋白酶体降解体系失去作用。研究显示β-TrCP水平增加与大肠癌细胞β-catenin激活，核NF-κB活性以及凋亡减少有关，而且大肠癌转移患者肿瘤中β-TrCP mRNA水平高于大肠癌无转移患者[10]。

与大肠癌预后有关的另一个E3泛素连接酶复合物成员是Skp2 (S期蛋白激酶2)。Skp2与调控蛋白Cks1 (细胞周期依赖激酶亚单位1)受Cdk抑制剂p27泛素化的影响。在大肠癌预后差的患者中可观察到这两种蛋白的过表达[11]。Skp2和Cks1与大肠癌患者的生存显著相关，并且独立于肿瘤所处阶段和恶性等级。p27是Skp2和Cks1的泛素化靶标。目前关于p27表达关系到大肠癌转移及生存预后的研究报道有很多，而且普遍认为大肠癌转移患者p27下调原因在于p27蛋白降解增加，由于细胞周期不同阶段p27 mRNA水平保持稳定，因此p27不是在转录水平被调控，而是在蛋白质的稳定性和降解水平通过磷酸化、泛素化和蛋白酶体降解完成[12]。而E3泛素连接酶复合物成员Skp2和Cks1过表达(及其可能附加的机制)导致p27稳定性降低和肿瘤侵袭性增加是大肠癌患者调控失败病情转移恶化的主要原因之一[13]。

3 UPS与大肠癌新药研发

大肠癌是最常见的肿瘤之一，由于饮食的原因发达国家的发病率高于发展中国家。尽管过去的几十年中引入了数种治疗大肠癌的新药物延长了早期患者的生命，但是转移性大肠癌仍是致命的，急需新的治疗药物。世界范围内针对该病活跃着数个研究路线，其中基于泛素蛋白酶体系统的级联反应特点，特异性干涉UPS的某一环节已被认为是一种很有前途的创新性抗肿瘤治疗方法，已逐渐成为大肠癌治疗研究的焦点[14]。

3.1 蛋白酶体抑制药治疗大肠癌的研究 考虑到蛋白酶体在包括肿瘤形成调控的细胞调控上的重要作用，许多研究已经着眼于蛋白酶体抑制因子对大肠癌的作用上。已经获得了对多发性骨髓瘤治疗调控的认可的蛋白酶抑制药硼替佐米(Bortezomib)，目前已被广泛地用于包括大肠癌在内的其他实体瘤的治疗研究[15]。目前大家更关注通过联合治疗方式进行大肠癌的治疗。实际上，Bortezomib和其他药物的联合是进一步开发大肠癌药物最有效的方法，而且已经着手开发。基于临床前期体外蛋白酶体抑制剂与拓扑异构酶Ⅰ抑制因子的联合，如今正在进行Bortezomib和依立替康扩大剂量的Ⅰ期研究。下一步对Bortezomib用于大肠癌的开发将研究其与大肠癌治疗药物如奥沙利铂，依立替康或者氟脲嘧啶及其同系物在严重缺少预治疗处理患者的联合应用，可能会附加没有明显叠加毒性的靶向抗VEGF或者抗EGFR的治疗如贝伐单抗，西妥昔单抗或者帕尼单抗。另一个策略是联合Bortezomib和已确定的新型定向治疗的细胞毒素药物，如Cox抑制因子或者脱乙酰基酶抑制因子联合用于大肠癌的治疗。

3.2 泛素连接酶作为大肠癌治疗靶标的潜力 泛素连接酶介导特异性底物的降解，因此最初认为靶定E3酶活性位点或者酶与底物的连接可能设计出不良反应较少的选择性药物。目前研究充分的一个明显靶点是具有致癌能力的RING型E3酶Hdm2, 肿瘤抑制蛋白p53的关键性负调控因子，调控细胞周期进展的多亚单位SCF连接酶。以Hdm2为靶点的研究试验了各种方法，包括抑制其表达，封闭其泛素连接酶活性和阻止Hdm2和p53间的相互作用以及能特异性靶定Hdm2的E3连接酶活性的小分子抑制剂的产生。另一个明显的靶点是Skp2，SCF连接酶复合物的底物特异性亚单位，它的失活在表达低水平的细胞周期抑制因子p27的肿瘤中可能是有益的。发展连接酶抑制药的另一个策略是识别能结合蛋白底物并能阻止多个连接酶行为的小分子，然后建立能特异性靶定野生型或者突变底物变异株的抑制药。如小复合物RITA(2,5-双(5-羟甲基-2-噻吩)呋喃)能结合p53的氨基末端并促进生长停滞[16]。目前，一种调控cullin-RING亚型泛素连接酶的小分子抑制因子“NEDD8-激发酶”的研究已进入临床一期试验[16]。总之，围绕泛素连接酶的抗肿瘤治疗为开发新的治疗策略带来了希望。

随着蛋白酶体抑制药和泛素连接酶相关药物的成功研发，E1抑制药作为有效的治疗靶标也逐渐受到关注。Millennium制药和Rigel制药已经公布了他们发现并获得专利的E1抑制药。这些泛素激活有关的小分子抑制药也成为癌症治疗的潜力军。

随着对UPS结构功能和重要的泛素网络调控作用的深入了解，通过调控该途径控制大肠癌的发生发展，改善患者预后以及开发出UPS抑制因子用于大肠癌的药物治疗将成为可能。

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(2013-10-09收稿 2013-12-20修回)

(责任编辑 梁秋野)

山东省科技发展计划项目(2008GG30002030)

陈世敏，博士，副主任技师，E-mail: happycsm@163.com

1. 250031济南，济南军区总医院实验诊断科；2. 102612北京，武警后勤部疾病预防控制中心

胡成进，E-mail：hcj6289@163.com

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