抑癌基因启动子区甲基化在食管鳞状细胞癌诊断、治疗和预后中的应用价值

吴 亮 ，李 闻 ，郭明洲

中国人民解放军总医院消化内科，北京100853

食管癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在我国分别位居恶性肿瘤的第五位和第四位［1］。食管癌的两个主要病理类型是鳞状细胞癌(鳞癌)和腺癌，约占所有食管肿瘤病理类型的90%以上［2］。西方国家以腺癌多见，而我国则以鳞癌为主［3］。近年来，尽管食管癌的治疗方法有了较大进展，但是食管癌患者的预后仍然很差，5年生存率仍低于20%［4］。食管癌的发生是多阶段、多基因参与的过程，其发生呈累积性改变［2］。越来越多的研究表明，遗传学(基因突变、杂合子丢失、纯合子缺失等)和表观遗传学(DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印迹、非编码RNA等)的改变是肿瘤发生的主要原因［5］，而DNA甲基化被认为是表观遗传学改变最常见的改变之一［6］。本文主要介绍了食管癌发生、发展过程中一些关键抑癌基因的启动子甲基化改变，以及相关改变在食管鳞癌早期诊断、预后评估以及治疗等方面的应用。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是指DNA在甲基转移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基与基因CpG二核苷酸中的胞嘧啶结合，形成5＇甲基胞嘧啶［7］。DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸，而人类基因组中CpG二核苷酸分布并不均一，其中位于基因启动子区的CpG二核苷酸富集区(长度＞200 bp，CG含量＞50%)被称为CpG岛，大约50%的人类基因含有CpG岛，且多位于基因的5＇端［8］。人类正常组织中，大多数CpG岛都是非甲基化的，并由多种转录因子调控基因表达。正常情况下，启动子区CpG岛甲基化与胚胎发生、细胞分化以及某些等位基因的特异性失活有关，如X染色体失活［9］;而在癌变组织中则往往表现为全基因组序列的低甲基化及启动子区域的高甲基化［7］。

2 抑癌基因启动子高甲基化与食管鳞癌的发生、发展

在食管癌发生、发展过程中，多种抑癌基因由于启动子区CpG岛高甲基化而导致表达下降或缺失。以下主要介绍近年来报道得较多的一些抑癌基因在食管鳞癌中的甲基化改变及其功能研究。

2.1 细胞周期调控相关基因 P16(INK4a/MTS1/CDKN2A)基因:定位于染色体9p21，又称作细胞周期素依赖激酶4的抑制物(CDK4I)，全长8.5 kb，是一种细胞周期调控基因。p16可以通过与cyclinD竞争结合CDK 4/6，抑制CDK 4/6的活性，使pRb处于非磷酸化或低磷酸化状态，抑制细胞周期从G1期向 S期过渡［10］。食管鳞癌组织中，p16基因启动子区甲基化率为10% ～88%［11-12］。王凡等［13］发现，p16 基因在正常食管上皮组织中未见明显甲基化改变，但是38.1%的食管不典型增生以及46.2%的食管鳞癌组织中存在p16基因启动子高甲基化以及表达下降，而且该基因的甲基化表达下降跟食管鳞癌的侵袭和转移相关［14］。提示该基因在食管鳞癌的发生、发展中具有重要作用。

2.2 侵袭、转移相关基因 CDH1(Cadherin 1，E-cadherin)基因:定位于染色体16q24。该基因编码的上皮型钙粘蛋白(E-cadherin，E-cad)属于跨膜糖蛋白家族成员，是介导同型细胞间黏附的黏附因子，在维持正常上皮细胞的细胞间连接方面起着重要作用［15］。食管鳞状细胞癌中，CDH1表达缺失跟肿瘤的侵袭、转移和不良预后相关［16］。CDH1启动子区高甲基化发生率为34% ～80%［17-18］。CDH1高甲基化的食管鳞癌组织中，97.5%伴随着 E-cad表达降低［19］，并且跟早期食管癌的复发相关［20］。体外研究发现，CDH1在完全甲基化的细胞株表达缺失，而去甲基化药物可以恢复其表达［17，19］。进一步证实 CDH1基因甲基化是导致其表达下调的重要机制。

2.3 增殖、分化相关基因 RARβ(Retinoic acid receptor beta)基因，定位于染色体3p24。人类RARβ基因包括三种亚型(β1，β2和β4)，分别编码相应的维甲酸受体亚型蛋白，通过介导维甲酸信号通路调控细胞的增殖和分化［21］。RARβ在启动子区高甲基化的食管鳞癌细胞株中表达降低，经去甲基化药物处理可以恢复其表达［22-23］，提示启动子区高甲基化是导致RARβ表达下调的重要机制。食管鳞癌组织中，RARβ基因启动子区甲基化率为22% ～72%［24-25］。Wang等［22］发现，12%的正常食管上皮、58%的食管不典型增生上皮以及70%的食管鳞癌组织中有RARβ基因启动子区CpG岛甲基化。食管鳞癌患者外周血DNA中RARβ基因甲基化率为63.2%，并且在术后明显下降［25］。提示该基因启动子高甲基化与食管鳞癌的疾病进程密切相关。

2.4 DNA修复相关基因 FHIT(Fragile histidine triad)基因，即脆性组氨酸三联体基因，定位于染色体3p14.2，基因全长约1 Mb，由10个外显子组成，覆盖FRA3B脆性位点、肾癌相关t(3;8)断裂点、抑癌基因PTPRG的5＇末端及HPV16整合位点［26］。在食管鳞癌中，FHIT基因启动子区甲基化率为6.4% ～84%［11，27］，FHIT 基因高甲基化是导致 FHIT 表达降低的主要机制之一。食管鳞癌组织中FHIT基因启动子高甲基化与患者吸烟史高度相关，而且FHIT高甲基化的早期食管癌患者预后不良［28］。在正常食管鳞状上皮细胞中，尼古丁也可以通过增加DNMT3B的表达，引起FHIT基因高甲基化以及蛋白表达下调［29］。FHIT表达缺失的食管鳞状细胞癌呈现出侵袭力和淋巴结转移能力增加［30-31］。

2.5 细胞凋亡相关基因 DAPK(death associated protein kinase)基因:定位于染色体9q21.33。该基因编码一种促凋亡丝/苏氨酸激酶，在多种凋亡信号通路中发挥作用［32-33］。食管鳞癌中DAPK甲基化率为26%～51%［18，24］，但是在正常食管上皮中却鲜有甲基化发生。此外，DAPK在食管鳞癌组织中的表达较癌旁组织明显降低。提示该基因的甲基化及表达下调是食管鳞癌的重要事件。

3 抑癌基因启动子高甲基化与食管鳞癌的早期诊断和预后评估

与传统的病理学检查方法比较，抑癌基因启动子的甲基化检测用于食管鳞癌早期诊断和预后评估具有明显的优势。一方面，比起RNA和蛋白质，DNA要稳定得多，而且取材方便，无论是组织DNA还是外周血DNA都可以用于甲基化检测［25，34］;另一方面，甲基化特异性PCR(MSP)技术作为DNA甲基化检测的常用方法，具有非常高的检测灵敏度，例如，MSP技术可以将1个甲基化的DNA拷贝从混有1 000个非甲基化的 DNA 拷 贝 中 检 测 出 来［35］。 p16［13］、ENG［36］、HIN［37］、SOX17［38］、TAC1［39］等抑癌基因启动子甲基化改变往往在早期食管鳞癌、甚至在不典型增生等食管癌的癌前病变中就已经出现，并且甲基化程度随着疾病的进展而升高，提示这些抑癌基因的启动子甲基化状态检测可以用于食管鳞癌的早期诊断。食管鳞癌患者术前外周血DNA中p16和RARβ基因甲基化率分别高达71.1%和63.2%，而在术后两种基因的甲基化程度均明显下降［25］，提示p16和RARβ基因甲基化水平对于食管鳞癌手术效果评价有重要价值。此外，CDH1和ITGA4基因启动子高甲基化与食管鳞癌的临床分期有重要关系，这两个基因的高甲基化状态分别与Ⅰ期和Ⅱ期食管鳞癌患者术后较高的复发风险以及较低的无病生存率高度相关［20］。而 Lee等［24］也发现，不伴有p14、DCC和CADM1启动子高甲基化改变的Ⅰ期食管鳞癌患的五年无病生存率，是p14、DCC和(或)CADM1基因启动子同时出现高甲基化的Ⅰ期食管鳞癌患者的7.13倍。提示这些抑癌基因启动子高甲基化可以作为Ⅰ期或Ⅱ期食管鳞癌患者术后复发的预后评价指标。

4 抑癌基因启动子区高甲基化与食管鳞癌的治疗

表观遗传学改变与遗传学改变的一个最大不同点就在于前者往往是可逆的，这就意味着表观遗传学所导致的基因表达改变可以通过一定的方法使之恢复正常表达，为肿瘤的防治提供了一条新的思路［40］。DNA甲基转移酶抑制剂由于可以通过抑制DNA甲基转移酶的活性，阻断DNA的高度甲基化，对于肿瘤的表观遗传学治疗具有重要意义。2004年，胞嘧啶核苷类似物阿扎胞苷获得美国食品药物管理局批准用于骨髓异常综合症的治疗［41］，成为历史上最先进入临床应用的DNA甲基转移酶抑制剂。2006年，作为阿扎胞苷脱氧核糖类似物，5-氮杂-2＇-脱氧胞苷(5Aza-dc，又名地西他滨)也获得美国食品药物管理局批准用于临床治疗。目前，很多新的DNA甲基转移酶抑制剂正在开发中，其中一些已经进入临床前研究，包括Zebularine(又名折布拉林)、RG108、EGCG、盐酸肼屈嗪和普鲁卡因胺等［42］。食管鳞癌细胞株中，原来存在甲基化表达沉默的 ENG［36］、CDH1［19］、RARβ［43］和 SOX17［38］等基因在5Aza-dc处理后得以恢复表达，并发挥抑制细胞侵袭［30］、细胞增殖、克隆形成以及裸鼠体内成瘤［38，43］等抑癌功能。尽管核苷类DNA甲基转移酶抑制剂可能在肿瘤的表观遗传学治疗方面发挥重要作用，但是目前尚没有关于该类药物用于食管鳞癌临床治疗的报道。该类药物固有的细胞毒性作用以及作用靶点的非选择性等缺陷，可能是制约其临床应用的重要因素［42］。因此，开发非核苷类的DNA甲基转移酶抑制剂以及进一步研究作用靶点高选择性的核苷类抑制剂，可能是今后肿瘤表观遗传学治疗药物研究的重要方向。

5 展望

食管鳞癌中大量抑癌基因因为启动子高甲基化而导致表达下调或失活，提示多个抑癌基因的遗传学和表观遗传学改变共同导致了食管鳞癌的发生，对这些基因的甲基化检测有利于食管鳞癌的早期诊断、预后评估以及靶向治疗。但是，一方面，单个抑癌基因甲基化检测灵敏度在不同研究报道中存在较大的波动，这与目前所应用的硫化修饰后的检测方法较复杂，不易掌握有关。因此，研发新的不需要硫化修饰的检测方法，将改善DNA甲基化检测在临床检测中的应用。联合检测多基因甲基化可能用于食管鳞癌的早期诊断、鉴别诊断和预后评估。另一方面，目前针对抑癌基因甲基化改变的研究积累尚不足，进一步对食管鳞癌甲基化组的研究有望揭开表观遗传在食管癌发生发展中的秘密，为食管癌的表观遗传治疗奠定基础。

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