Notch信号通路在肝脏发育中的研究进展

程 萍 ，郭传勇

上海市同济大学附属第十人民医院消化科，上海200072

1917年，Morgan在果蝇体内发现某种基因的部分功能缺失会在果蝇翅膀的边缘造成缺口(notch)，80年代命名此基因为Notch基因。随后大量的研究表明Notch信号途经在神经细胞的分化、脊椎动物体节的发育等过程中发挥着重要作用，尤其在肝脏发育成熟过程中作用巨大［1］。Notch信号通路主要通过介导细胞的分化抑制信号，从而达到调控肝脏生长发育的目的。

1 Notch信号通路简介

Notch信号通路有4个核心组件，分别为:DSL配体(Jagged1，Jagged2，Delta-like 1，Delta-like 3，Deltalike 4)、转录因子(CBF-l，Suppressor of hairless，Lag 1)、Notch 受体(Notch1-4)和靶基因(HES、Hey)［2］。其信号通路途经可概括为:Delta→Notch→酶切→NICD→进入细胞核→CSL-NICD复合体→基因转录。Notch及其配体均为单次跨膜蛋白，当配体(如Delta)和相邻细胞的Notch受体结合后，Notch信号被激活，在G分泌酶(GSI)的酶切作用下，释放出具有核定位信号的细胞内区域NICD(Notch intracellular domain，NICD)，NICD进而被转运至细胞核内，并与CSL家族转录因子结合，激活Notch靶基因的表达［3］。CSL能识别并结合位于Notch诱导基因的启动子上的特定的DNA 序列(GTGGGAA)［4］。当 NICD 不存在时，CSL为转录抑制因子。当结合NICD时，CSL能诱导相关靶基因的表达，从而引发后续分子事件［5］。Notch信号会上调细胞膜表面的Notch分子，同时下调其配体Delta的表达［6］;Delta表达的下调又会上调细胞自身Notch分子的表达。这种正反馈机制使细胞Notch及其配体表达的细微差别在发育过程中被逐渐放大，从而决定了细胞的不同分化方向［7］。同时，Notch信号转导能不借助第二信使和蛋白激酶的参与，直接接受邻近细胞的信号并传到细胞核，激活相关转录因子的表达［8］。这两种特性为细胞分化起始过程的精确调控奠定了不可或缺的基础。

2 Notch信号通路在肝脏发育各个阶段的作用

肝脏作为最重要的器官之一，在其发育中经历了复杂的过程:包括内胚层阶段肝脏的特化、肝祖细胞(hepatoblasts)的形成、肝芽(liver bud)的出现和增殖细胞命运的选择(肝向和胆管方向的分化)以及最后细胞的成熟等。包括Notch信号通路在内的各种相关细胞信号通路和转录因子共同发挥作用调控这一过程。

2.1 Notch在胚胎肝脏的形成时的作用 哺乳动物的肝脏特化起源于腹侧壁前肠末端内胚层，随着肝细胞相关基因的激活，在胚胎发育到14～20体节期腹侧壁上皮细胞增生向外突起形成肝芽［即形成了肝脏区域(小鼠约在胚胎8.5 d)］，构成肝芽的这些细胞称之为肝祖细胞，是构成肝脏的主要原始细胞。肝脏祖细胞具有双向分化潜能，能够向肝脏细胞和胆管上皮细胞分化。作为细胞发育过程中的方向盘，Notch信号通路对细胞命运选择有着极其重要的引导作用。在肝向和胆管方向的分化过程中，Notch信号通路被激活，抑制肝脏祖细胞的肝向分化，肝脏祖细胞和肝细胞的表面标志物如白蛋白的表达下调，而胆管细胞标志物如 ck7、ck19、整合素 β4 和 HNF-1β 表达上调［9］。由此我们推测Notch信号通路控制肝脏祖细胞向胆向分化。而后续的研究也证实Notch信号通路在肝脏祖细胞中的激活抑制其向肝脏分化并诱导其向胆管细胞特点分化。Geisler等［10］的研究发现，Notch-Delta信号通路通过改变胎肝时期肝脏祖细胞中特定转录因子的表达水平促进其向胆管细胞分化，而Notch信号下调则可以诱导肝脏祖细胞向肝细胞分化。此外NICD在肝脏祖细胞中的异常高表达，下调白蛋白的表达，不仅可以诱导其向胆管细胞分化而且有效的抑制肝母细胞向肝细胞分化。Croquelois等［11］用Notch基因敲除小鼠模型也证明了这一点，Notch1的缺失导致肝细胞持续增殖，进而发展为结节性再生性增生，这表明Notch信号通路可以抑制肝细胞的增殖。另外体外实验也表明，Jagged-Notch途径控制着胆向发育。如Notch功能缺失突变则造成小鼠胆管结构异常，功能紊乱。肝脏祖细胞在肝实质分化为成熟的肝细胞，在门静脉区周围则分化为胆管细胞。我们推断门静脉周围的某种物质对肝脏祖细胞分化为胆管细胞起着促进作用。研究发现，Jagged1蛋白聚集在胚胎肝脏的门静脉周围，Notch2蛋白在包括肝脏祖细胞在内的大多数肝细胞中表达。肝脏祖细胞与Jagged1的细胞在门静脉周围区互相作用，从而促进胆管方向的分化［12］。胆管板亦是从这两种细胞的边界形成的。这些结果均表明Notch信号在门静脉区肝脏祖细胞中的激活导致肝脏祖细胞向胆管细胞分化。Notch信号通路在肝脏祖细胞分化过程中起的重要作用可见一斑。但是有趣的是，HES-1和Notch2的失活只会导致胆管异型［13］，并不能扰乱胆管分化。解释这一现象有两个假说:(1)这是Notch信号通路在胚胎期肝脏表达时有一个或多个突变基因的备份［14］。(2)Notch2基因在胆管分化形成后便会失去作用［15］。

除了Notch信号下调则可以诱导肝祖细胞向肝细胞分化外，抑瘤蛋白M(oncostatin M，OSM)信号通路也可以促进肝脏祖细胞向肝脏细胞分化并进一步成熟为具有代谢功能的成熟肝脏细胞［16］。

2.2 Notch信号通路在肝脏发育成熟阶段的作用肝细胞的成熟受时间和空间各因素调节，肝脏在胚胎期和出生后都是个不断成熟的持续过程［17］。Kyrmizi等［18］研究表明，调节肝细胞成熟的有核心六因子(core of 6 factor)，包括肝细胞核因子(HNF)-1α、HNF-1β、蛋白质 FoxA2、HNF-4α1、HNF-6 和核受体同源蛋白 LRH-1 等。Vanderpool等［19］通过 HNF-6、RBP-J基因缺失小鼠模型的研究发现肝细胞的发育受核心因子和Notch信号通路等共同调控。Croquelois等［11］研究发现，成年小鼠条件性剔除受体Notch1后，肝细胞的增殖能力可升高8倍，进而导致肝脏重量/体质量的指数增加40%，由此看来Notch信号会抑制成年小鼠肝细胞的增殖。而 Kohler等［20］研究提示，Notch/Jagged途径在肝脏再生过程中可被激活，Notch配体Jagged1可以促进肝细胞的增殖，从而提示Notch信号对肝细胞增殖存在正性调控。可见Notch对肝细胞的调控是一个十分复杂的过程，受到内因和外因的共同作用。

胆管细胞的发育也是一个持续分化成熟的过程，而且我们了解到胆管细胞根据各自所在的分支导管位置，在形态上以及功能异质性上持续发生变化［21］，但是其中具体的调控过程尚未明朗。研究发现Notch1或者Notch2的异常表达会导致胆管上皮细胞的异常分化和异位［22］。由此我们推测胆管细胞的发育与Notch信号通路相关。Kodama等［14］研究发现，Notch信号通路的靶基因HES-1的缺陷会导致小鼠胆管结构缺乏，而这个过程则与Jagged1及其受体Notch2信号通路息息相关。Jagged1在旁门静脉间质、门静脉成纤维细胞以及星状细胞中表达，且已有研究证实，胆管细胞与Notch2作用后，可以刺激表达HES-1，促进胆管细胞的增殖，直接调节了胆管形成。

3 Notch信号通路与肝脏再生及发育异常

Notch信号通路在肝脏胚胎发育和成熟过程中都起了重要作用。不仅如此，Notch与肝脏再生和发育异常也有很大关系。肝脏损伤或肝部分切除后，剩余肝脏会代偿性再生，肝脏再生的实质就是肝血窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)所分泌的肝细胞生长因子(hepatocytegrowth factor，HGF)和白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)的作用致使肝细胞的不断增殖、扩增［23］。Zong等［15］通过成功构建 Notch/RBP-J信号缺失的小鼠模型及进行体外研究均发现阻断Notch信号则会导致肝再生功能的障碍，肝细胞、LSEC增殖能力减弱，肝脏失代偿性增大，LSEC去分化，肝血窦阻塞，肝细胞合成、分泌白蛋白能力减弱。Notch信号缺失会导致肝脏发育异常具体表现在肝脏稳态的丧失，肝细胞、LSEC的异常增殖，正常肝小叶结构遭到破坏。由此可见Notch信号通路在肝脏再生和发育进程中扮演着重要角色，可以直接调控肝细胞、LSEC的生物学活性而改变肝再生的进程。Tanimizu等［9］研究表明，Notch信号通路可以作用于下游效应物Jagged1蛋白，进而调节肝祖细胞发育的相关转录因子的表达水平来控制这一过程。Jagged1基因突变会使Notch信号通路异常，导致肝内胆管发育缺陷，引发Alagille综合征。Alagille综合征是一种常染色体显性遗传的多脏器发育异常，累及的脏器包括心、肝、骨骼、眼等［24］。染色体分析发现，人类 Jagged1基因(JAG1)与该病密切相关，Alagile综合征患者的一个JAG1等位基因发生了多种移码突变，不能产生正常的翻译产物，使体内JAG1的水平低于正常，提示该综合征是JAG1分子单倍体性缺乏(haploinsufieiency)所致［25］。另有研究发现Notch2是除了JAG1外导致该病的第二大基因［26］。而 Nijjar等［27］在多个病肝小胆管处发现Jagged1表达增强更提示Notch信号在肝脏胆管缺陷中有着重要作用。介于Notch途径在胚胎发育中所起得重要作用，其他多种先天性发育异常疾病可能也与此途径有关。

综上所述，Notch信号通路在肝脏发育成熟过程中的重要性已经明确。虽然对于Notch信号通路在肝脏组织细胞间如何相互作用，调节细胞的发育成熟的具体机制尚未明了。但是这些理论大大促进了分子生物学的进展，也启迪了很多临床实际运用，如使干细胞体外肝向诱导成为可能，促进了肝脏胆管疾病的分析研究和基因治疗，为肝脏疾病的治疗提供新的思路。甚至我们可以期望应用到肝脏疾病的再生治疗，作为器官移植的来源途径之一。同时我们也相信，随着时间的推移和对Notch信号调控研究的深入，我们有能力利用Notch信号通路打开调控细胞命运之门。

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